ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: FUNÇÕES, TIPOS E EXEMPLOS - BIOLOGIA - 2024

As enzimas de restrição são endonucleases empregadas por certas arquéias e bactérias para inibir ou "restringir" a disseminação de vírus em seu interior. Eles são especialmente comuns em bactérias e fazem parte de seu sistema de defesa contra DNA estranho, conhecido como sistema de restrição / modificação.

Essas enzimas catalisam a clivagem do DNA de banda dupla em locais específicos, de forma reproduzível e sem o uso de energia adicional. A maioria requer a presença de cofatores como o magnésio ou outros cátions divalentes, embora alguns também requeiram ATP ou S-adenosil metionina.

Esquema de reação da enzima de restrição HindIII (Fonte: Helixitta via Wikimedia Commons)

Endonucleases de restrição foram descobertas em 1978 por Daniel Nathans, Arber Werner e Hamilton Smith, que receberam o Prêmio Nobel de Medicina por sua descoberta. Seu nome geralmente deriva do organismo onde são observados pela primeira vez.

Essas enzimas são amplamente utilizadas no desenvolvimento de métodos de clonagem de DNA e outras estratégias de biologia molecular e engenharia genética. Suas características específicas de reconhecimento de sequência e a capacidade de cortar sequências perto de locais de reconhecimento os tornam ferramentas poderosas na experimentação genética.

Fragmentos gerados por enzimas de restrição que atuaram em uma molécula de DNA particular podem ser usados ​​para recriar um "mapa" da molécula original usando informações sobre os locais onde a enzima cortou o DNA.

Algumas enzimas de restrição podem ter o mesmo local de reconhecimento no DNA, mas não necessariamente o cortam da mesma maneira. Assim, existem enzimas que cortam deixando pontas rombas e enzimas que cortam deixando pontas coesivas, que têm diferentes aplicações em biologia molecular.

Atualmente, existem centenas de diferentes enzimas de restrição disponíveis comercialmente, oferecidas por diferentes casas comerciais; Essas enzimas funcionam como tesouras moleculares "personalizadas" para diferentes fins.

Recursos

As enzimas de restrição cumprem a função oposta das polimerases, uma vez que hidrolisam ou quebram a ligação éster dentro da ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes em uma cadeia de nucleotídeos.

Em biologia molecular e engenharia genética são ferramentas amplamente utilizadas para a construção de vetores de expressão e clonagem, bem como para a identificação de sequências específicas. Eles também são úteis para a construção de genomas recombinantes e apresentam grande potencial biotecnológico.

Avanços recentes na terapia gênica fazem uso atual de enzimas de restrição para a introdução de genes específicos em vetores que são veículos para o transporte de tais genes em células vivas, e que provavelmente têm a capacidade de se inserir no genoma celular para realizar mudanças permanentes.

Mecanismo de ação

As enzimas de restrição podem catalisar a clivagem de DNA de banda dupla, embora algumas sejam capazes de reconhecer sequências de DNA de banda única e até mesmo RNA. O corte ocorre após o reconhecimento das sequências.

O mecanismo de ação consiste na hidrólise da ligação fosfodiéster entre um grupo fosfato e uma desoxirribose no esqueleto de cada fita de DNA. Muitas das enzimas são capazes de cortar no mesmo local que reconhecem, enquanto outras cortam entre 5 e 9 pares de bases antes ou depois.

Normalmente, essas enzimas cortam na extremidade 5 'do grupo fosfato, dando origem a fragmentos de DNA com uma extremidade 5' fosforila e uma extremidade 3 'hidroxila terminal.

Como as proteínas não entram em contato direto com o sítio de reconhecimento no DNA, elas devem ser translocadas sucessivamente até que o sítio específico seja alcançado, talvez por meio de mecanismos de "deslizamento" na fita de DNA.

Durante a clivagem enzimática, a ligação fosfodiéster de cada uma das fitas de DNA é posicionada dentro de um dos locais ativos das enzimas de restrição. Quando a enzima deixa o local de reconhecimento e clivagem, ela o faz por meio de associações transitórias não específicas.

Tipos

Cinco tipos de enzimas de restrição são atualmente conhecidos. Aqui está uma breve descrição de cada um:

Enzimas de restrição tipo I

Essas enzimas são grandes proteínas pentaméricas com três subunidades, uma para restrição, uma para metilação e uma para reconhecimento de sequência no DNA. Essas endonucleases são proteínas multifuncionais capazes de catalisar reações de restrição e modificação, possuem atividade ATPase e também DNA topoisomerase.

Enzimas desse tipo foram as primeiras endonucleases a serem descobertas, elas foram purificadas pela primeira vez na década de 1960 e têm sido estudadas em grande profundidade desde então.

As enzimas do tipo I não são amplamente utilizadas como ferramenta biotecnológica, uma vez que o local de clivagem pode estar a uma distância variável de até 1.000 pares de bases do local de reconhecimento, o que os torna pouco confiáveis ​​em termos de reprodutibilidade experimental.

Enzimas de restrição do tipo II

Eles são enzimas compostas de homodímeros ou tetrâmeros que cortam o DNA em locais definidos entre 4 e 8 bp de comprimento. Esses locais de clivagem são tipicamente palíndrômicos, ou seja, reconhecem sequências que são lidas da mesma maneira nas duas direções.

Muitas das enzimas de restrição do tipo II em bactérias cortam o DNA quando reconhecem seu caráter estranho, uma vez que não tem as modificações típicas que seu próprio DNA deveria ter.

Estas são as enzimas de restrição mais simples, uma vez que não requerem outro cofator além do magnésio (Mg +) para reconhecer e cortar as sequências de DNA.

A precisão das enzimas de restrição do tipo II em reconhecer e cortar sequências simples no DNA em posições precisas as torna uma das mais amplamente utilizadas e indispensáveis ​​na maioria dos ramos da biologia molecular.

Dentro do grupo de enzimas de restrição do tipo II, existem múltiplas subclasses classificadas de acordo com certas propriedades que são únicas para cada uma. A classificação dessas enzimas é feita pela adição de letras do alfabeto, de A a Z seguindo o nome da enzima.

Algumas das subclasses mais conhecidas por sua utilidade são:

Subclasse IIA

Eles são dímeros de diferentes subunidades. Eles reconhecem sequências assimétricas e são usados ​​como precursores ideais para a geração de enzimas de corte.

Subclasse IIB

Eles são constituídos por um ou mais dímeros e cortam o DNA em ambos os lados da sequência de reconhecimento. Eles cortam as duas fitas de DNA em um intervalo de pares de bases antes do local de reconhecimento.

Subclasse IIC

Enzimas deste tipo são polipeptídeos com funções de divisão e modificação de fitas de DNA. Essas enzimas cortam ambas as fitas de forma assimétrica.

Subclasse IIE

As enzimas dessa subclasse são as mais utilizadas em engenharia genética. Eles têm um sítio catalítico e geralmente requerem um efetor alostérico. Essas enzimas precisam interagir com duas cópias de sua sequência de reconhecimento para realizar uma clivagem eficiente. Dentro desta subclasse estão as enzimas EcoRII e EcoRI.

Enzimas de restrição do tipo III

As endonucleases de restrição do tipo III são compostas por apenas duas subunidades, uma é responsável pelo reconhecimento e modificação do DNA, enquanto a outra é responsável pela clivagem da sequência.

Essas enzimas requerem dois cofatores para sua função: ATP e magnésio. As enzimas de restrição deste tipo possuem dois locais de reconhecimento assimétricos, translocam o DNA de uma forma dependente de ATP e cortam-no entre 20-30 bp adjacente ao local de reconhecimento.

Enzimas de restrição tipo IV

As enzimas do tipo IV são fáceis de identificar, pois cortam o DNA com marcas de metilação; elas são compostas por várias subunidades diferentes que são responsáveis ​​por reconhecer e cortar a sequência de DNA. Essas enzimas usam GTP e magnésio divalente como cofatores.

Os locais de clivagem específicos incluem fitas de nucleotídeo com resíduos de citosina metilada ou hidroximetilada em uma ou ambas as fitas de ácidos nucleicos.

Enzimas de restrição tipo V

Esta classificação agrupa as enzimas do tipo CRISPER-Cas, que identificam e cortam sequências de DNA específicas de organismos invasores. Enzimas cas usam uma fita de RNA guia sintetizado por CRISPER para reconhecer e atacar organismos invasores.

As enzimas classificadas como tipo V são polipeptídeos estruturados por enzimas tipo I, II e II. Eles podem cortar seções do DNA de quase qualquer organismo e com uma ampla faixa de comprimento. Sua flexibilidade e facilidade de uso tornam essas enzimas uma das ferramentas mais amplamente utilizadas na engenharia genética hoje, junto com as enzimas do tipo II.

Exemplos

Enzimas de restrição têm sido utilizadas para a detecção de polimorfismos de DNA, especialmente em estudos genéticos populacionais e estudos evolutivos utilizando DNA mitocondrial, a fim de obter informações sobre as taxas de substituições de nucleotídeos.

Atualmente, os vetores usados ​​para a transformação de bactérias para diversos fins possuem locais de multiclonagem onde são encontrados locais de reconhecimento para múltiplas enzimas de restrição.

Entre essas enzimas, as mais populares são EcoRI, II, III, IV e V, obtidas e descritas pela primeira vez de E. coli; HindIII de H. influenzae e BamHI de B. amyloliquefaciens.

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