XANTHOMONAS CAMPESTRIS: DESCRIÇÃO, CULTIVO E PATOLOGIAS - BIOLOGIA - 2025

Xanthomonas campestris é uma espécie de proteobactéria (classe: Gamma Proteobacteria, ordem: Xantomonadales, família: Xanthomonadaceae) fitopatogênica que afeta importantes plantações.

X. campestris apresenta uma fase epifítica na planta em que não a agride. Esta fase é anterior à infecção, é gerada quando as bactérias proliferam devido a variações ambientais favoráveis. A infecção por esta espécie causa uma variedade de sintomas na planta infectada que podem eventualmente degenerar em morte.

Figura 1. Sintomas causados ​​pela infecção por X. campestris. Fonte: autor Ninjatacoshell, Wikimedia Commons.

X. campestris também é bem conhecido por produzir o biopolímero goma xantana ou xantana, um polissacarídeo que excreta no meio (exopolissacarídeo) e aumenta a viscosidade de soluções aquosas.

O exopolissacarídeo xantana foi o primeiro subproduto comercialmente importante gerado pelos processos de fermentação do amido de milho. Atualmente é produzido em grandes quantidades e tem diversas aplicações devido às suas características como espessante e emulsificante. Xanthan é usado nas indústrias alimentícia, farmacêutica, cosmética, agrícola e petrolífera, entre outras.

Descrição

Xanthomonas campestris é um bacilo saprofítico gram-negativo, aeróbio obrigatório e facultativo. É móvel, com largura entre 0,2 e 0,6 µm e comprimento entre 0,8 e 2,9 µm. Pode aparecer como um indivíduo solitário ou formando filamentos, rodeado por xantana, o exopolissacarídeo que eles produzem.

O xantano favorece a formação de biofilmes de X. campestris e também exerce ação protetora nas comunidades estabelecidas nessa estrutura, quando ocorrem mudanças bruscas de temperatura, pH, radiação ultravioleta, variações osmóticas marcantes e / ou diminuição da umidade.

Interação com a planta

Esta espécie possui vários mecanismos para contornar as respostas de defesa das plantas que infecta. A primeira barreira da planta contra uma infecção bacteriana é a parede celular e substâncias superficiais com atividade antimicrobiana.

X. campestris pode infectar a planta através de seus estômatos foliares (poros onde ocorre a troca gasosa com o meio ambiente), seus hidátodos (um tipo de estoma pelo qual o excesso de água exsuda) ou através de feridas existentes.

As plantas geralmente fecham seus estômatos quando atacadas por microorganismos. No entanto, X. campestris produz um fator de virulência que impede o fechamento dos estômatos, favorecendo a entrada de mais bactérias do ambiente externo na planta.

Quando as bactérias estão dentro da planta, elas impedem o transporte de água, obstruindo os tecidos vasculares. O resultado é a necrose das folhas e murcha das partes infectadas.

Além disso, X. campestris produz um composto denominado β- (1,2) glucano cíclico neutro que impede a expressão de genes de defesa na planta. Esses compostos podem estar associados ao espaço periplasmático bacteriano ou podem ser excretados para o meio extracelular, favorecendo a mobilidade da bactéria, sua virulência e a formação de biofilmes.

Xanthan

A xantana produzida pela Xanthomonas atua como fator de virulência, suprimindo a resposta imunológica da planta infectada e aumentando a capacidade de infecção da bactéria.

A xantana é um polissacarídeo composto por unidades de 5 açúcares que se repetem (2 glicoses, 2 manoses e 1 ácido glicurônico) e polimerizam.

A síntese da xantana depende de um operon denominado goma cluster (conjunto de genes que compõem uma unidade funcional), que possui 12 genes que estão sob o controle de uma única região promotora.

Isolamento de

X. campestris pv. campestris pode ser isolado do tecido foliar que apresenta manchas em forma de "V" ou do tecido vascular danificado, ou do colo da planta, ou seja, das áreas lesadas da planta.

Para obter cepas de X. campestris, a área lesada é selecionada como uma amostra (manchas de folhas ou frutos ou cancro). Se nenhuma lesão for observada na planta, o tecido mais suscetível a ser danificado é retirado como amostra e analisado por meio de cultura e pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR).

Mídia cultural

Entre os meios de cultura usados ​​estão os seguintes:

Interpolação de leite

Para um isolamento inicial de microrganismos de amostras de tecido vegetal, o meio Milk Tween (MT) pode ser aplicado:

10 ml de leite desnatado, 0,25 g de CaCl ₂, 10 g de peptona protease nº 3, 15 g de ágar Bacto, 0,5 g de tirosina, 10 ml de Tween 80, 80 mg de cefalexina (em 2 ml de NaOH em 4%), 200 g de cicloheximida (em 2 ml de metanol 75%), 100 mg de vancomicina (em 1 ml de água destilada).

As soluções de leite desnatado, cefalexina, cicloheximida e vancomicina devem ser esterilizadas por filtração e adicionadas ao meio a 50 ° C.

King's B

Depois de permitir o crescimento das colônias bacterianas no MT, as mais semelhantes a X. campestris (colônias de pigmentação amarela com 72 e 120 horas de cultivo) podem ser transferidas para o meio B de King:

20 g de peptona de protease No.3, 20 g de agar agar, 1,5 g de K ₂ HPO _4, 1,5 g de MgSO ₄ x / H ₂ O, 10 ml de glicerol, 700 de água destilada.

O meio deve ser aquecido a 80 ° C com agitação, completado até 1 L com água destilada e homogeneizado, e o pH ajustado para 7,2. Esterilize a 121 ° C por 15 minutos.

O rico meio de cultura PYM ou YMM também foi usado na cultura de X. campestris.

Figura 2. Cultura de Xanthomonas em meio sólido. Fonte: Jarober3, via Wikimedia Commons

PYM

Para preparar o PYM, a cada 1000 ml de volume total, deve-se adicionar: 10 g de glicose, 5 g de extrato de peptona, 3 g de extrato de malte e 3 g de fermento.

Se você quiser crescer em meio sólido em placas de Petri, então 15 g de ágar também devem ser adicionados à mistura.

Ymm

Para preparar o meio YMM, você precisa para cada 1000 ml de volume total: 10 g de glicose, 1 ml de solução de MgSO ₄: 7H ₂ O (10 g / L), 1 ml de uma solução de CaCl ₂ (22 g / L), 1 ml de uma solução de K ₂ HPO ₄ (22 gr / L), 1 ml de uma solução de FeCl ₃ em HCl 0,1 M (2 g / L), casaminoácidos 0,3% m / v (aminoácidos de hidrólise de caseína) e solução de glutamato de sódio 11% v / v.

Condições de incubação

As condições de incubação das cepas bacterianas de X. campestris devem ser 27 ou 28 ° C e, no caso de meios de cultura líquidos, a agitação contínua deve ser mantida a 200 rotações por minuto (rpm).

Produção de xantana

Se a produção de xantana em um processo de fermentação for desejada, glicose, sacarose ou xarope de milho (entre 20 e 40 g / L), entre outros nutrientes que fornecem nitrogênio, devem ser fornecidos como fonte de carbono.

Detecção de atividade metabólica

Para detectar a presença de X. campestris viável no tecido vegetal, alguns pesquisadores recomendam medir a atividade metabólica, ao invés do crescimento microbiano em cultura de laboratório.

A medição da atividade metabólica foi realizada por meio de um indicador de viabilidade através do sistema de transporte de elétrons. Esse composto é chamado de tetrazólio e seus sais aceitam elétrons do hidrogênio, gerando formazan, substância insolúvel em água. Assim, o aparecimento no meio do formazan é um indicador da atividade metabólica celular.

Um dos meios de cultura X. campestris para realizar este teste de viabilidade contém cloreto de tetrazólio (TTC), cloreto de trifeniltetrazólio e outros aditivos, como cloreto de sódio e açúcares. É um meio com as seguintes substâncias para um volume total de 500 ml: 5 g de peptona, 0,5 g de caseína hidrolisada, 2,5 g de glicose e 8,5 g de ágar.

Fisiopatologia

A bactéria X. campestris é o agente causador de inúmeras doenças que afetam as folhas das plantas ornamentais (como Anthurium andreanum) e do feijão (Phaseolus vulgaris L.). Também afetam os frutos de frutas de caroço, como amêndoa, nectarina, cereja, pêssego, damasco, ameixa, entre outros.

Sabe-se que X. campestris afeta a família das Brassicaceae ou crucíferas, estando entre as 10 espécies fitopatogênicas mais perigosas para a atividade agrícola, principalmente nos trópicos.

Por exemplo, X. campestris causa podridão negra em couve-flor (Brassica oleracea), brócolis (B. napus), couve chinesa (B. pekinensis), nabo (B. rapa), mostarda (B nigra), rabanete (Rhaphanus sativus) e repolho (B. fruticulosa).

Figura 3. Folha afetada por X. campestris. Fonte: David B. Langston, via Wikimedia Commons

Os sintomas produzidos por X. campestris aparecem inicialmente nas folhas e, a seguir, podem aparecer nos frutos e ramos. Envolvem manchas foliares irregulares e angulares amareladas (1 a 5 mm de diâmetro), limitadas pelas nervuras que eventualmente são necrotizadas.

Também ocorrem queimaduras foliares; manchas nas frutas; murcha vascular e aparecimento de lesões cloróticas ou necróticas em forma de "V".

As manchas aparecem nas bordas da folha e em torno de sua nervura central. A perda de folhas pode ocorrer na planta. Manchas verdes aparecem nos frutos que se tornam necróticos, podendo também quebrá-los. Cankers também podem ocorrer.

Referências

1. Dow, JM, Crossman, L., Findlay, K., He, Y.-Q., Feng, J.-X., & Tang, J.-L. (2003). A dispersão do biofilme em Xanthomonas campestris é controlada pela sinalização célula-célula e é necessária para a virulência total às plantas. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100 (19), 10995–11000. doi: 10.1073 / pnas.1833360100
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