CITOQUÍMICA: HISTÓRIA, OBJETO DE ESTUDO, UTILIDADE E TÉCNICAS - BIOLOGIA - 2025

A citoquímica compreende uma série de técnicas que se baseiam na identificação e disposição de substâncias específicas no interior da célula. É considerada um ramo da biologia celular que combina a morfologia celular com a estrutura química.

Segundo Bensley, fundador da aplicação da citologia moderna, expressa que o objetivo da citoquímica é descobrir a organização química das células para compreender os mistérios da vida. Bem como estudar as mudanças dinâmicas que ocorrem durante as diferentes fases funcionais.

1: Doença extramamária de Paget. (Hematoxilina-Eosina) 2: placas senis observadas no córtex cerebral em um paciente com doença de Alzheimer. (Impregnação de prata) 3: língua de coelho, fibras de colágeno (azul). Fibras musculares (faixas roxas). (Tricrômico de Masson). 4: Tecido hepático com degeneração gordurosa. (Sudão III) 5: Fígado inflamado. Necrose. (Azul de toluidina) Fontes: Wikipedia. com / Usuário: KGH / Arquivos de domínio público / Mohit Lalwani

Dessa forma, é possível determinar o papel metabólico desempenhado por essas substâncias no interior da célula.

A citoquímica usa dois métodos principais. O primeiro é baseado em procedimentos químicos e físicos. Essas técnicas recorrem ao uso do microscópio como um instrumento indispensável para visualizar as reações químicas que ocorrem sobre substâncias específicas dentro da célula.

Exemplo: o uso de corantes citoquímicos, como a reação de Feulgen ou reação PAS, entre outros.

O segundo método é baseado em bioquímica e microquímica. Com esta metodologia é possível determinar quantitativamente a presença de produtos químicos intracelulares.

Entre as substâncias que podem ser reveladas em um tecido ou estrutura celular estão as seguintes: proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídeos.

História da citoquímica

As técnicas citoquímicas, desde sua invenção, ajudaram a entender a composição das células e, ao longo do tempo, uma variedade de técnicas emergiu que usa vários tipos de corantes com afinidades e fundamentos diferentes.

Posteriormente, a citoquímica abriu novos horizontes com o uso de certos substratos para mostrar colorimetricamente a presença de enzimas ou outras moléculas dentro da célula.

Da mesma forma, outras técnicas surgiram, como a imunocitoquímica, que tem ajudado muito no diagnóstico de muitas doenças. A imunocitoquímica é baseada em reações antígeno-anticorpo.

Por outro lado, a citoquímica também utiliza substâncias fluorescentes chamadas fluorocromos, que são excelentes marcadores para a detecção de certas estruturas celulares. Devido às características do fluorocromo, destaca as estruturas às quais foi fixado.

Que estuda?

As diversas técnicas citoquímicas utilizadas em uma amostra biológica têm algo em comum: revelam a presença de um tipo específico de substância e conhecem sua localização na estrutura biológica avaliada, seja um tipo de célula ou um tecido.

Essas substâncias podem ser enzimas, metais pesados, lipídios, glicogênio e grupos químicos definidos (aldeídos, tirosina, etc.).

As informações fornecidas por essas técnicas podem orientar não só para a identificação de células, mas também para o diagnóstico de diversas patologias.

Por exemplo, as manchas citoquímicas são muito úteis na diferenciação entre os vários tipos de leucemias, uma vez que algumas células expressam certas enzimas ou substâncias-chave e outras não.

Por outro lado, deve-se observar que para que o uso da citoquímica seja possível, as seguintes considerações devem ser tomadas:

1) A substância deve ser imobilizada no local onde se encontra naturalmente.

2) A substância deve ser identificada utilizando substratos que reagem especificamente com ela e não com outros compostos.

Utilitário

As amostras que podem ser estudadas por meio de técnicas citoquímicas são:

- Sangue periférico estendido.

- Medula óssea estendida.

- Tecidos fixados por técnicas histoquímicas.

- Células fixadas por citocentrifugação.

As técnicas citoquímicas são de grande suporte na área de hematologia, pois são amplamente utilizadas para auxiliar no diagnóstico e na diferenciação de certos tipos de leucemias.

Por exemplo: As reações de esterase são usadas para diferenciar a leucemia mielomonocítica da leucemia monocítica aguda.

Os esfregaços de medula óssea e de sangue periférico desses pacientes são semelhantes, pois algumas células são difíceis de identificar morfologicamente sozinhas. Para isso, é realizado o teste de esterase.

No primeiro, as esterases específicas são positivas, enquanto no segundo, as esterases não específicas são positivas.

São também muito úteis na histologia, pois, por exemplo, o uso da técnica de coloração com metais pesados ​​(impregnação com prata) tinge as fibras reticulares de cor marrom intensa no tecido miocárdico.

Técnicas em citoquímica

As técnicas mais utilizadas serão explicadas a seguir:

- Uso de corantes

Os corantes usados ​​são muito diversos nas técnicas citoquímicas e podem ser classificados de acordo com vários pontos de vista:

De acordo com o radical com o qual eles têm afinidade

Eles são divididos em: ácidos, básicos ou neutros. São os mais simples e os mais usados ​​ao longo da história, permitindo-nos distinguir os componentes basofílicos dos acidofílicos. Exemplo: coloração com hematoxilina-eosina.

Nesse caso, os núcleos das células ficam corados de azul (levam hematoxilina, que é a coloração básica) e os citoplasmas, de vermelho (levam eosina, que é a coloração ácida).

De acordo com a cor que fornecem

Eles podem ser ortocromáticos ou metacromáticos. Os ortocromáticos são aqueles que tingem as estruturas da mesma cor do corante. Por exemplo, o caso da eosina, cuja cor é vermelha e mancha de vermelho.

Por outro lado, os metacromáticos coram estruturas com uma cor diferente das suas, como, por exemplo, a toluidina, cuja cor é azul e ainda assim mancha o violeta.

Corantes vitais ou supravitais

São corantes inofensivos, ou seja, dão cor às células e permanecem vivas. Essas manchas são chamadas de vitais (por exemplo, azul de tripano para corar macrófagos) ou supravital (por exemplo, verde de Janus para corar mitocôndrias ou vermelho neutro para corar lisossomos).

- Detecção de lipídios por meio de corantes lipossolúveis

Tetróxido de ósmio

Ele mancha os lipídios (ácidos graxos insaturados) de preto. Essa reação pode ser observada com o microscópio de luz, mas como esse corante é de alta densidade também pode ser visualizado com um microscópio eletrônico.

Sudan III

É um dos mais usados. Esse corante se difunde e se solubiliza nos tecidos, acumulando-se nas gotículas lipídicas. A cor é vermelho escarlate.

Sudão mancha preta B

Produz melhor contraste do que os anteriores porque é capaz de se dissolver também em fosfolipídios e colesterol. É útil para detectar grânulos azurófilos e específicos de granulócitos maduros e seus precursores. Portanto, ele identifica as leucemias mieloides.

- Coloração do grupo aldeído (coloração de Schiff com ácido periódico)

A coloração de Schiff com ácido periódico pode detectar três tipos de grupos aldeído. Eles são:

- Aldeídos livres, naturalmente presentes nos tecidos (reação plasmática).

- Aldeídos produzidos por oxidação seletiva (reação PAS).

- Aldeídos gerados por hidrólise seletiva (reação de Feulgen).

Reação PAS

Essa coloração é baseada na detecção de certos tipos de carboidratos, como o glicogênio. O ácido periódico de Schiff quebra as ligações CC dos carboidratos devido à oxidação dos grupos glicólicos 1-2, conseguindo liberar grupos aldeídos.

Grupos aldeído livres reagem com o reagente de Schiff e formam um composto vermelho-púrpura. O aparecimento da cor vermelho-púrpura mostra uma reação positiva.

Este teste é positivo em células vegetais, detectando amido, celulose, hemicelulose e peptinas. Enquanto em células animais, detecta mucinas, mucoproteínas, ácido hialurônico e quitina.

Além disso, é útil no diagnóstico de leucemias linfoblásticas ou eritroleucemia, entre outras patologias do tipo mielodisplásico.

No caso de carboidratos ácidos, a coloração alcian blue pode ser usada. O teste é positivo se for observada uma cor azul claro / turquesa.

Reação plasmática

A reação plasmática revela a presença de certos aldeídos alifáticos de cadeia longa, como palma e estearal. Esta técnica é aplicada em cortes histológicos congelados. É tratado diretamente com o reagente de Schiff.

Reação de Feulgen

Esta técnica detecta a presença de DNA. A técnica consiste em submeter o tecido fixado a uma hidrólise de ácido fraco para posteriormente fazer reagir com o reagente de Schiff.

A hidrólise expõe os grupos desoxirribose aldeído na ligação desoxirribose-purina. O reagente de Schiff reage então com os grupos aldeído que foram deixados livres.

Essa reação é positiva nos núcleos e negativa no citoplasma das células. A positividade é evidenciada pela presença de uma cor vermelha.

Se essa técnica for combinada com o verde de metila-pironina, é possível detectar simultaneamente o DNA e o RNA.

- Colorações citoquímicas para estruturas de proteínas

Para isso, pode-se utilizar a reação de Millon, que utiliza nitrato de mercúrio como reagente. Estruturas contendo aminoácidos aromáticos ficarão manchadas de vermelho.

- Colorações citoquímicas que usam substratos para mostrar a presença de enzimas

Essas manchas são baseadas na incubação da amostra biológica com um substrato específico e o produto da reação subsequentemente reage com os sais diazo para formar um complexo colorido.

Esterases

Essas enzimas estão presentes nos lisossomas de algumas células sanguíneas e são capazes de hidrolisar ésteres orgânicos liberando naftol. Este último forma um corante azo insolúvel quando se liga a um sal diazo, manchando o local onde ocorre a reação.

Existem vários substratos e dependendo de qual deles é usado, esterases específicas e esterases não específicas podem ser identificadas. As primeiras estão presentes em células imaturas da série mieloide e as últimas em células de origem monocítica.

O substrato utilizado para a determinação de esterases específicas é: cloroacetato de naftol-AS-D. Enquanto para a determinação de esterases não específicas, vários substratos podem ser usados, tais como acetato de naftol AS-D, acetato de alfa naftilo e butirato de alfa naftilo.

Em ambos os casos, as células ficarão vermelhas quando a reação for positiva.

Mieloperoxidase

Esta enzima é encontrada nos grânulos azurófilos das células granulocíticas e monócitos.

Sua detecção é utilizada para diferenciar as leucemias de origem mieloide das linfoides. As células que contêm mieloperoxidases ficam amarelo ocre.

Fosfatases

Essas enzimas liberam ácidos fosfóricos de diferentes substratos. Eles diferem entre si de acordo com a especificidade do substrato, o pH e a ação de inibidores e inativadores.

Entre as mais conhecidas estão as fosfomonoesterases que hidrolisam ésteres simples (PO). Exemplo: fosfatase alcalina e fosfatase ácida, bem como fosfamidases que hidrolisam as ligações (PN). Eles são usados ​​para diferenciar síndromes linfoproliferativas e para o diagnóstico de leucemia de células pilosas.

- Colorações tricrômicas

Tricrômio Mallary-Azan

Eles são úteis para diferenciar o citoplasma das células das fibras do tecido conjuntivo. As células ficam vermelhas e as fibras de colágeno, de azul.

Tricrômico de Masson

Tem a mesma utilidade que a anterior, mas, neste caso, as células ficam vermelhas e as fibras de colágeno, de verde.

- Corantes que coram organelas específicas

Janus Green

Ele mancha seletivamente as mitocôndrias.

Sais de prata e ácido ósmico

Mancha o aparelho de Golgi.

Azul de toluidina

Mancha os corpos de Nissi

Sais de prata e PAS

Eles mancham as fibras reticulares e a lâmina basal.

Orceína e resorcina fucsina

Eles tingem as fibras elásticas. No primeiro, são tingidos de marrom e, no segundo, de um azul profundo ou roxo.

- Outras técnicas utilizadas em citoquímica

Uso de substâncias fluorescentes ou fluorocromos

Existem técnicas que usam substâncias fluorescentes para estudar a localização de uma estrutura em uma célula. Essas reações são visualizadas com um microscópio especial denominado fluorescência. Exemplo: técnica IFI (imunofluorescência indireta).

Detecção de componentes celulares por imunocitoquímica

Essas técnicas são muito úteis na medicina, pois ajudam a detectar uma determinada estrutura celular e também a quantificá-la. Esta reação é baseada em uma reação antígeno-anticorpo. Por exemplo: técnicas de ELISA (Enzyme Immuno Assay).

recomendações

- É necessária a utilização de esfregaços de controle para avaliar o bom desempenho dos corantes.

- Esfregaços frescos devem ser usados ​​para a coloração citoquímica. Se não for possível, eles devem ser mantidos protegidos da luz e armazenados a 4 ° C.

- Deve-se ter cuidado para que o fixador usado não influencie negativamente a substância a ser investigada. Em outras palavras, deve-se evitar que seja capaz de extraí-lo ou inibi-lo.

- O tempo de uso dos fixadores deve ser respeitado, pois em geral deve durar apenas alguns segundos, pois a exposição do esfregaço por mais tempo ao fixador pode danificar algumas enzimas.

Referências

1. "Citoquímica." Wikipédia, a enciclopédia livre. 30 de junho de 2018, 17:34 UTC. 9 de julho de 2019, 02:53 Disponível em: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Métodos de impregnação metálica para o estudo das fibras reticulares do miocárdio: estudo comparativo. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Disponível em: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Citoquímica da fosfatase ácida: considerações metodológicas. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. Disponível em: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Biologia celular e molecular. 11ª edição. Editorial Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Ferramentas clássicas para estudar biologia celular. TP 1 (material complementar) - Biologia Celular. Disponível em: dbbe.fcen.uba.ar