COLORAÇÃO COM HEMATOXILINA-EOSINA: CARACTERÍSTICAS, USOS, TÉCNICAS - QUÍMICA - 2024

A hematoxilina-eosina é uma técnica de coloração que utiliza a combinação dos corantes hematoxilina e eosina. Este par de corantes forma uma dupla perfeita, já que a hematoxilina atua como um corante básico e a eosina é um corante ácido.

A designação de corantes básicos ou ácidos não se refere ao pH obtido em solução, mas antes fala da proporção predominante em termos de cargas aniônicas ou catiônicas que possuem ou pela localização do grupo cromóforo.

Epitélio colunar ciliado corado com hematoxilina - eosina (HE) Fonte: Todd Straus e Vladimir Osipov

Nesse sentido, a hematoxilina é considerada um corante básico (catiônico) e, portanto, possui afinidade por estruturas ácidas, como o núcleo das células. Já a eosina, sendo um corante ácido (aniônico), tem afinidade por estruturas alcalinas ou básicas, como o citoplasma celular.

Por esse motivo, essa combinação de corantes é amplamente utilizada para a coloração de tecidos, pois permite a distinção clara de núcleos e citoplasmas. Os núcleos coram em azul escuro ou roxo e o citoplasma em rosa.

A coloração pela hematoxilina-eosina é uma das técnicas de coloração mais utilizadas na área de histologia e citologia, devido ao seu fácil manuseio e baixo custo. É usado para visualizar células, fibras nervosas espessas e a presença de certos microrganismos nos tecidos, como: parasitas, fungos e bactérias, entre outros.

Caracteristicas

Hematoxilina

A hematoxilina é um corante neutro. Entretanto, o componente que fornece a cor (cromóforo) está localizado no centro catiônico ou básico da molécula. Daí sua afinidade por estruturas ácidas. Sua fórmula química é C ₁₆ H ₁₄ O ₆ e seu nome científico é 7,11b-diidroindeno cromeno-3, 4,6a, 9,10 (6 H) -pentol.

Ele cora principalmente os núcleos das células, por serem muito ricos em ácidos nucléicos. Também pode manchar inclusões citoplasmáticas de origem viral.

Para que a hematoxilina corante, ela deve estar em um estado oxidado e ligado a um metal. Este último servirá para se fixar ao tecido, ou seja, atuará como mordente.

Quando a hematoxilina é oxidada, é denominada hemateina. A oxidação é obtida pela exposição ao oxigênio (envelhecimento) do reagente ou por substâncias que auxiliam na sua oxidação (oxidação química).

Eosin

A eosina é um corante que mancha de vermelho ou rosa. É insolúvel em água, embora haja uma versão solúvel em água. Geralmente, a eosina é preparada por dissolução em álcool (etanol a 95 °).

Ele cora citoplasmas, fibras musculares, organelas citoplasmáticas e colágeno, mas não cora os núcleos das células. Isso ocorre porque ele é carregado negativamente, portanto, tem afinidade por estruturas carregadas positivamente.

Existem dois tipos de eosina "Y" e "B". A eosina "Y" é conhecida como eosina amarela. Seu nome científico é tetrabromofluoresceína e sua fórmula química é C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅.

Por outro lado, a eosina "B" às vezes é chamada de eritrosina B azulada. Seu nome científico é dibromodinitro fl uoresceína e a fórmula é C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉. Ambos são muito semelhantes e a diferença entre usar um ou outro não é realmente perceptível. No entanto, a mais popular é a eosina "Y".

A eosina tem a propriedade de distinguir entre uma célula viva e uma célula morta, pois só é capaz de atravessar a membrana para tingir seu citoplasma quando as células estão mortas, deixando o citoplasma da célula incolor se permanecer vivo.

Formulários

Coloração de fibra nervosa

Fibras nervosas espessas podem ser coradas e identificadas com hematoxilina-eosina. No entanto, não é útil para tingir fibras nervosas finas, uma vez que uma coloração com prata é necessária para visualizar as últimas.

Manchas histológicas de seção de pele

Na coloração da camada córnea da pele, o corante que atua é a eosina, já que neste nível as células não têm núcleo.

Na camada granular da pele, a hematoxilina cora fortemente os grânulos de querato-hialina dentro das células granulares. Ao contrário, a camada espinhosa da pele é levemente manchada com hematoxilina, enquanto a camada basal ou germinativa é bastante manchada.

A eosina cora o citoplasma de todas as células e a intensidade da cor pode variar de camada para camada.

Coloração de hematoxilina-eosina de amostras de fezes

Gómez et al., Em 2005 demonstraram que a coloração com hematoxilina-eosina foi mais eficaz na identificação de casos de amebíase devido a Entamoeba histolytica e Entamoeba dispar do que o método de visualização a fresco (solução salina e lugol) em pacientes com doença diarreica aguda.

Também demonstrou ser altamente sensível na detecção de eritrofagocitose (amebas que envolveram eritrócitos).

Coloração de cortes histológicos para o diagnóstico de infecção

Walwyn et al., Em 2004 propôs o uso de colorações histológicas para detectar microrganismos causadores de infecção.

Usando a coloração de hematoxilina-eosina, eles foram capazes de visualizar infecções causadas por Clostridium, Actinomyces, spirillae ou Candida. Eles também puderam observar a presença do parasita Sarcoptes escabiei em cortes de pele e inclusões virais por citomegalovírus e herpes em cortes de vários tecidos.

Técnicas

Para amostras histológicas

A coloração da seção histológica passa por uma série de etapas. A primeira coisa é obter o corte histológico. Este deve ser encerado para posteriormente obter os cortes (ultrafinos) com um micrótomo. A técnica consiste nas seguintes etapas:

1-Eliminação do excesso de parafina: para isso pode-se usar xilol ou Heme-D, imergir por 3-5 minutos.

2-Reidratação da amostra: consegue-se mergulhando a amostra em diferentes concentrações de álcoois (etanol) por ordem decrescente (100 °, 90 °, 70 °). Em todos os casos, por 7 minutos.

3-Eliminação do excesso de álcool: para isso é imerso em água por 7 minutos.

4-Coloração com hematoxilina: a amostra é imersa por 6 a 10 minutos em uma bandeja contendo hematoxilina. O tempo de exposição depende do tamanho e da espessura da amostra.

5-Eliminação do excesso de hematoxilina: é lavado com água por 5 minutos e em seguida uma passagem rápida (10-20 segundos) é realizada em álcool ácido. Posteriormente, é lavado novamente com água por 5 minutos. Em seguida, é imerso em etanol a 96 ° por 1 minuto.

6-Coloração com eosina: para isso, a amostra é imersa por 5 minutos na bandeja de eosina.

7-Desidratação da amostra: para isso, ela passa pelas bandejas de álcool (etanol), mas desta vez em ordem crescente. (70 °, 90 °, 100 °). (Por 5 segundos, 5 segundos, 1 minuto respectivamente).

8-Esclarecimento da amostra: para isso, é exposta ao xilol por 5 a 10 minutos e seca para selar permanentemente com bálsamo do Canadá ou outro material semelhante.

Para amostras de fezes procurando

O esfregaço é feito em lâmina com as fezes do paciente e fixado com álcool 80% por 5 minutos. A folha é imersa em hematoxilina por 5 minutos e imediatamente lavada com água.

Posteriormente, é rapidamente imerso em álcool ácido e, em seguida, em água com amônia. É lavado com água. É colorido por 5 minutos em eosina. A amostra é desidratada como explicado na técnica anterior e finalmente enxaguada com xileno.

Preparação de reagentes

- Hematoxilina

Em um litro de água destilada, dissolva 50 gramas de sulfato de potássio ou amônio e alumínio. Quando completamente dissolvido, adicione 1 grama de hematoxilina cristalizada. Quando estiver completamente dissolvido, 1 g de ácido cítrico é adicionado juntamente com 50 g de hidrato de cloral e 0,2 g de iodato de sódio.

A mistura é fervida por 5 minutos, depois deixada para esfriar e filtrada para remover quaisquer partículas sólidas que tenham permanecido. O reagente assim preparado pode ser usado imediatamente.

- Eosin

Pode ser preparado à base de álcool ou à base de água.

Eosina alcoólica

Em 100 ml de etanol a 95 ° dissolver 0,5 gramas de eosina "Y". Em seguida, adicione algumas gotas de ácido acético glacial.

2% de eosina aquosa

Em 1250 ml de água destilada dissolver 25 gramas de eosina "Y" solúvel em água. Em seguida, adicione algumas gotas de ácido acético glacial.

Álcool ácido

Meça 0,5 ml de ácido clorídrico concentrado e complete a 100 ml com álcool absoluto.

Água de amônia

Meça 0,5 mL de amônia concentrada e complete a 100 mL com água destilada.

Referências

1. Navarrete, G. Histologia da pele. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130-133. Disponível em: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Identificação de Entamoeba histolytica / E. Dispar pela técnica de ameba fresca vs sua coloração com hematoxilina-eosina na diarreia aguda. Rev Mex Pediatr 2005; 72 (3); 109-112. Disponível em: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M. Utilidade de técnicas histológicas para o diagnóstico de infecção em peças anatômicas. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 (2). Disponível em: scielo.sld
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6. Eosin. Wikipédia, a enciclopédia livre. 7 de novembro de 2018, 08:18 UTC. 4 de agosto de 2019, 22:13 en.wikipedia.org
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