MEDIO DE: JUSTIFICATIVA, PREPARAÇÃO, USOS E LIMITAÇÕES - BIOLOGIA - 2025

O OF ou meio de fermentação de glicose é um ágar semissólido especialmente desenvolvido para o estudo do metabolismo oxidativo e fermentativo de carboidratos em um importante grupo de microrganismos que não Enterobacteriaceae, chamados bacilos Gram negativos não entéricos.

Foi criado por Hugh e Leifson; esses pesquisadores perceberam que os meios convencionais de estudar a produção de ácido a partir de carboidratos não eram adequados para esse grupo específico de bactérias.

A. Meio OF comercial basal. B. Tubos com meio OF semeado. Fonte: A e B Fotos tiradas pelo autor MSc. Marielsa Gil.

Isso ocorre porque os bastonetes Gram negativos não entéricos geralmente produzem baixas quantidades de ácidos, ao contrário das Enterobacteriaceae.

Nesse sentido, o meio OF possui características especiais que podem detectar as pequenas quantidades de ácido formadas, tanto pela via oxidativa quanto pela fermentativa. Essas diferenças estão relacionadas à quantidade de peptonas, carboidratos e ágar.

Este meio contém menos peptonas e maior concentração de carboidratos, reduzindo assim os produtos que alcalinizam o meio pelo metabolismo das proteínas e aumentando a produção de ácidos pelo uso dos carboidratos.

Por outro lado, a diminuição da quantidade de ágar favorece a disseminação do ácido produzido pelo meio, além de permitir observar a motilidade.

O meio OF consiste em peptona, cloreto de sódio, azul de bromotimol, fosfato dipotássico, ágar e um carboidrato. O carboidrato mais comum é a glicose, mas outros podem ser usados ​​de acordo com o que se deseja estudar, como lactose, maltose, xilose, entre outros.

Base

Como qualquer meio de cultura, o meio OF deve conter substâncias nutritivas que garantam o crescimento bacteriano; essas substâncias são peptonas.

Por sua vez, o carboidrato fornece energia e ao mesmo tempo serve para estudar o comportamento do microrganismo contra ele, ou seja, permite que a bactéria seja classificada como um organismo oxidativo, fermentativo ou não sacarolítico.

O meio OF contém uma proporção de peptona / carboidrato de 1: 5 em oposição ao meio convencional de 2: 1. Isso garante que a quantidade de aminas alcalinas formadas a partir da degradação das peptonas não neutralize a formação de ácidos fracos.

Por outro lado, o meio contém cloreto de sódio e fosfato dipotássico. Esses compostos estabilizam osmoticamente o meio e regulam o pH, respectivamente. O azul de bromotimol é o indicador de pH, que muda a cor do meio de verde para amarelo com a produção de ácido.

Alguns microrganismos podem usar carboidratos por meio das rotas oxidativas ou de fermentação, enquanto outros não usam nenhuma das duas.

Isso depende das características de cada microrganismo. Por exemplo, alguns microorganismos aeróbicos estritos podem oxidar certos carboidratos, e anaeróbios facultativos podem oxidar e fermentar dependendo do ambiente ao seu redor, enquanto outros não oxidam ou fermentam carboidratos (asacarolítico).

Finalmente, há uma modificação do meio OF recomendado pelo CDC que contém uma base OF especial com vermelho de fenol como indicador.

Processo de oxidação

O processo de oxidação da glicose não requer a fosforilação da glicose, como o processo de fermentação. Neste caso, o grupo aldeído é oxidado a um grupo carboxila, resultando em ácido glucônico. Este, por sua vez, é oxidado a 2-cetoglucônico.

Este último se acumula ou se decompõe em duas moléculas de ácido pirúvico. Este sistema requer a presença de oxigênio ou algum composto inorgânico como o aceptor final de elétrons.

A produção de ácidos por esta rota é mais fraca do que a obtida pela fermentação.

Processo de fermentação

Para que a fermentação da glicose ocorra por qualquer uma das rotas disponíveis, ela deve primeiro ser fosforilada, tornando-se glicose-6-fosfato.

A fermentação da glicose pode seguir várias rotas, sendo a principal delas a rota Embden-Meyerhof-Parnas, mas também podem seguir a rota Entner-Doudoroff, ou a rota hexose monofosfato Warburg-Dickens, também conhecida como a da degradação das pentoses.

A rota escolhida dependerá do sistema enzimático que o microrganismo possui.

Via Embden-Meyerhof- Parnas

Na fermentação da glicose pela rota Embden-Meyerhof-Parnas, ela é dividida em duas moléculas de triose, para posteriormente ser degradada em diversos compostos de carbono, até a formação do gliceraldeído-3-fosfato. Daí se origina uma substância intermediária, que é o ácido pirúvico.

A partir daí, vários tipos de ácidos mistos serão formados que podem variar de uma espécie para outra.

Este sistema ocorre na ausência de oxigênio e requer um composto orgânico como o aceptor final de elétrons.

Via Entner-Doudoroff

Na fermentação da glicose pela via de Entner-Doudoroff, a glicose 6-fosfato se torna glucono-ᵼ-lactona-6-fosfato e a partir daí é oxidada a 6-fosfogluconato e 2-ceto-3-desoxi-6- fosfogluconato, para finalmente formar ácido pirúvico. Esta via precisa de oxigênio para que a glicólise ocorra.

Via de degradação de pentoses ou via de monofosfato de Warburg-Dickens Hexoxa

Esta rota é um híbrido das 2 acima. Começa de forma semelhante à via de Entner-Doudoroff, mas posteriormente o gliceraldeído-3-fosfato é formado como um precursor do ácido pirúvico, como ocorre na via de Embden-Meyerhof-Parnas.

Preparação

Pesar:

2 g de peptona

5 g de cloreto de sódio

10 g de D-glicose (ou o carboidrato a ser preparado)

0,03 g de azul de bromotimol

3 gr de ágar

0,30 g de fosfato dipotássico

1 litro de água destilada.

Misture todos os compostos exceto o carboidrato e dissolva em 1 litro de água destilada. Aquecer e agitar até dissolver completamente.

No resfriamento a 50 ° C, são adicionados 100 ml de glicose a 10% (filtrado).

Distribua assepticamente 5 ml de meio OF em tubos de ensaio com tampa de algodão e autoclave a 121 ° C, 15 libras de pressão por 15 minutos.

Permitir solidificar na posição vertical.

O pH do meio deve ser 7,1 A cor do meio preparado é verde.

Guarde na geladeira.

Formulários

O meio OF é um meio especial para determinar o comportamento metabólico de um microrganismo em relação a um carboidrato. Especialmente para aqueles que formam pouco ácido, fraco ou nenhum ácido.

Semeado

Para cada microrganismo, são necessários 2 tubos OF, ambos devem ser inoculados com o microrganismo a ser estudado. A colônia é retirada com cabo reto e a punção é feita no centro do tubo sem atingir o fundo; Diversas punções podem ser feitas, desde que não haja interesse em observar a motilidade.

Uma camada de vaselina líquida estéril ou parafina derretida estéril (aproximadamente 1 a 2 ml) é adicionada a um dos tubos e rotulada com a letra "F". O outro tubo é deixado original e rotulado como "O". Ambos os tubos são incubados a 35 ° C e observados diariamente por até 3 a 4 dias.

Interpretação

Metabolismo e produção de gás

Tabela: Classificação dos microrganismos de acordo com seu comportamento em tubos OF abertos (oxidativos) e fechados (fermentativos)

Fonte: Elaborado pelo autor MSc. Marielsa gil

O gás é observado com a formação de bolhas ou deslocamento do ágar.

Deve-se notar que um organismo que apenas oxida a glicose, mas não a fermenta, não será capaz de fermentar outros carboidratos, em qualquer caso, apenas a oxidará. Portanto, nesta situação o tubo selado para o estudo de outros carboidratos será omitido.

Motilidade

Além disso, a motilidade pode ser vista no meio OF.

Motilidade positiva: crescimento que não se limita à área de inoculação. Há crescimento nas laterais do tubo.

Motilidade negativa: crescimento apenas no inóculo inicial.

Controle de qualidade

As seguintes cepas podem ser utilizadas como controle de qualidade: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Moraxella sp. Os resultados esperados são:

1. coli: Fermentador de glicose (tubos amarelos e brilhantes).
2. aeruginosa: Oxidante de glicose (tubo amarelo aberto e selo verde ou azul).
3. Moraxella sp: Não sacarolítico (tubo aberto verde ou azul, tubo verde selado).

Limitações

-Alguns microrganismos não podem crescer em meio OF. Nestes casos, o teste é repetido, mas 2% de soro ou 0,1% de extrato de levedura é adicionado ao meio.

-As reações de oxidação muitas vezes só são observadas próximo à superfície e o resto do meio pode permanecer verde, da mesma forma que é considerado positivo.

Referências

1. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial Panamericana. Bons ares. Argentina.
4. Laboratórios Francisco Soria Melguizo. 2009. OF Glucose Medium. Disponível em:
5. Laboratórios Conda Pronadisa. DE meio de glicose. Disponível em: condalab.com
6. Laboratórios BD. 2007. OF Basal Medium. Disponível em: bd.com