MEIO LÖWENSTEIN-JENSEN: FUNDAÇÃO, PREPARAÇÃO E USO - BIOLOGIA - 2025

O meio Löwenstein-Jensen é um meio sólido seletivo para o isolamento e desenvolvimento de bactérias do gênero Mycobacterium, como Mycobacterium tuberculosis, M. avium, entre outras, com exceção da espécie leprae, que não é cultivável.

Bactérias do gênero Mycobacterium não crescem em meios de cultura convencionais, portanto foi necessário projetar um meio especial para seu isolamento. O meio original foi criado por Löwenstein e posteriormente modificado por Jensen.

Meio Löwenstein-Jensen com colônias de Mycobacterium tuberculosis. Fonte: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., cortesia da Biology Image Library

A modificação consistiu na eliminação do corante vermelho do Congo, substituindo-o por uma concentração maior de verde malaquita. Também alterou as concentrações de citrato de magnésio e fosfato monopotássico.

O meio Löwenstein-Jensen atualmente contém amido de batata, asparagina, citrato de magnésio, fosfato monopotássico, sulfato de magnésio, verde malaquita, ácido nalidíxico, cicloheximida, lincomicina, ovos batidos, glicerina e água.

As micobactérias são normalmente isoladas de locais não estéreis, como expectoração, urina, abscessos, entre outros. Isso significa que a maioria das amostras conterá a microbiota usual da área, além do patógeno.

É por isso que o meio Löwenstein-Jensen contém uma série de inibidores em sua composição representados por verde malaquita, antibióticos e antifúngicos.

Além disso, as amostras provenientes de locais não estéreis devem ser descontaminadas e neutralizadas antes de serem semeadas no meio Löwenstein-Jensen.

Base

A presença de ovo e glicerina no meio Löwenstein-Jensen estimula o crescimento de micobactérias, pois fornecem os ácidos graxos e proteínas necessários ao desenvolvimento desses microrganismos.

O meio Löwenstein-Jensen contém verde malaquita, que é um inibidor da microbiota que o acompanha. Mas também contém ácido nalidíxico (35 µg / mL), que inibe a microbiota Gram negativa, cicloheximida (400 µg / mL), que inibe fungos saprofíticos e leveduras, e lincomicina (2 µ / mL), que inibe a microbiota Gram positiva.

Algumas casas comerciais preferem adicionar a seguinte combinação de antibióticos: polimixina B 200.000 unidades / L, anfotericina B 10 mg / L, carbenicilina 50 mg / L e trimetoprima 10 mg / L.

Este meio não contém ágar, portanto a solidificação do meio ocorre devido à coagulação da albumina presente no ovo durante a esterilização.

Preparação

Pesar 37,3 g do meio desidratado em 600 ml de água destilada, aos quais foram previamente adicionados 12 ml de glicerol. A mistura é aquecida, mexendo freqüentemente até a completa dissolução. Autoclave o meio a 121 ° C por 15 minutos.

Por outro lado, uma suspensão homogênea de 1000 ml de ovos frescos deve ser preparada em condições assépticas. Adicione a suspensão de ovo aos 600 ml de meio preparado à temperatura de 50 - 60 ° C, evitando bolhas de ar.

Soluções de antibióticos também são adicionadas após esterilização na autoclave.

Despeje o meio em tubos de ensaio estéreis com tampa de rosca. Aqueça os tubos a 85 ° C por 45 minutos em uma posição inclinada.

A cor do meio preparado é verde água-marinha e pode apresentar manchas esbranquiçadas devido à presença de lipídios de ovo.

O pH do meio deve ser 7,2 ± 0,2

Armazene os tubos na geladeira e protegidos da luz direta até o uso. Tempere antes de semear.

Há uma modificação do meio chamada "modificação Gruft do Löwenstein Jensen". Este contém os mesmos compostos que o meio clássico, mas RNA-5mg / 100 mL é adicionado, e como inibidores contém verde malaquita 0,025 g / 100 mL, penicilina 50 U / mL e ácido nalidíxico 35 ug / mL.

Formulários

O meio Löwenstein-Jensen é usado para o isolamento de micobactérias de vários tipos de amostras. A coloração Ziehl-Neelsen é recomendada para qualquer amostra na qual se suspeite da presença de micobactérias.

Algumas amostras vêm de locais estéreis, mas outras não. As amostras não estéreis devem ser descontaminadas conforme apropriado:

Escarro

As amostras de escarro devem ser descontaminadas da seguinte forma: determinar a quantidade de amostra de escarro em ml e adicionar a mesma quantidade de NaOH 4% à amostra e incubar a 37 ° C.

Agite a mistura freqüentemente dentro de 30 minutos. Posteriormente, centrifugue a 3000 RPM por 30 minutos.

Descarte o sobrenadante sobre uma solução desinfetante fenólica. Use o sedimento para a semeadura, mas primeiro o pH deve ser neutralizado.

Para neutralizar o sedimento, 5% de H ₂ SO ₄ é usado na presença do indicador vermelho de fenol até atingir um pH neutro que provoca uma cor salmão.

Lavagem gástrica, lavagem brônquica e aspirado brônquico

Neste caso, a amostra deve ser centrifugada a 3000 RPM por 30 minutos. O sobrenadante é descartado e o pellet é usado. Para descontaminar o sedimento, adicionar 3 ml de NaOH 4% e agitar freqüentemente a 37 ° C por um período de meia hora.

Centrifugue novamente, o sobrenadante é descartado e o pellet é usado. Este último deve ser neutralizado conforme explicado na amostra de escarro.

Urina

Deixe a amostra repousar na geladeira por 24 horas. Separe o sobrenadante. O sedimento restante deve ser centrifugado por 30 minutos a 3000 RMP. Rejeite o sobrenadante novamente e reconstitua o pellet com 3 ml de solução fisiológica estéril.

Adicione 3 ml de NaOH a 4% e proceda à descontaminação e neutralização conforme descrito anteriormente.

Líquido ascite, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano

Nesse tipo de amostra ela é centrifugada e o sobrenadante é descartado. Faça um Gram no sedimento ou observe diretamente no microscópio; Se as bactérias não forem observadas, a etapa de descontaminação não é necessária, nem a etapa de neutralização.

Neste caso, a amostra pode ser semeada diretamente com o sedimento. Se houver bactérias, proceda à descontaminação e neutralização conforme descrito acima.

Biópsias

A este tipo de amostra, deve-se adicionar 5 ml de água destilada para posteriormente centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e centrifugue novamente o pellet a 3500 RPM por 30 minutos. Use o sedimento para semear o meio de cultura.

Swab laríngeo

O swab deve ser colocado em um tubo estéril contendo partes iguais de água destilada e NaOH 4%. O cotonete deve ser pressionado contra as paredes do tubo para que a amostra seja diluída no líquido. Centrifugue e use o sedimento. Neutralize o sedimento conforme já descrito.

Semeado

O meio Löwenstein-Jensen é inoculado pela adição de 0,5 ml da amostra na superfície do meio. Gire o tubo para distribuir a amostra por todo o meio. Não use cabo de platina.

Um segundo tubo contendo meio Stonebrink pode ser semeado para isolar Mycobacterium bovis e outras espécies que não crescem em meio Löwenstein-Jensen.

Incubação

Os tubos inoculados são incubados aerobicamente a 37 ° C, com a tampa ligeiramente solta e inclinada cerca de 5 ° e protegida da luz. O ambiente pode ser enriquecido com 5–10% de dióxido de carbono. Verifique as culturas duas vezes por semana até que as colônias apareçam.

Quando a amostra for absorvida, as tampas são fechadas. O tempo máximo de incubação é de 8 semanas, se após este tempo não houver crescimento é relatado como negativo.

Controle de qualidade

As seguintes cepas podem ser usadas como controle de qualidade:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus 320 ° F ATCC de 19615, Cryptococcus 320 ° F 320 ° F ATCC de nematococcus

Espera-se um excelente desenvolvimento para as três primeiras espécies mencionadas, para M. fortuitum o crescimento deve ser bom, enquanto para M. bovis pouco ou nenhum crescimento é esperado. Enquanto isso, espécies diferentes do gênero Mycobacterium devem ser totalmente inibidas.

Limitações

O meio preparado deve ser protegido da luz, a exposição prolongada à luz faz com que o meio passe de verde para azul; neste caso, o meio não pode mais ser usado. Isso ocorre porque o verde malaquita é fotossensível.

O meio, por conter ovos, pode ser facilmente contaminado se não for manuseado assepticamente. Ele pode ser dissolvido se ficar contaminado com bactérias proteolíticas.

O cultivo e o manejo de bactérias do gênero Mycobacterium requerem pessoal qualificado e atento às medidas de biossegurança que devem ser seguidas para evitar a contaminação ou contaminação de terceiros.

O HCl não deve ser usado na etapa de neutralização devido à formação de cloreto de sódio, que pode ser tóxico para o bacilo de Koch.

As amostras devem ser mantidas refrigeradas e protegidas da luz enquanto não estão sendo processadas.

Referência

1. Laboratórios Francisco Soria Melguizo. 2009. Meio seletivo Löwenstein-Jensen. Disponível em: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Meio Löwenstein-Jensen. Disponível em: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Meio Löwenstein-Jensen. Disponível em: foodsafety.neogen.com.
4. "Meio Löwenstein-Jensen." Wikipédia, a enciclopédia livre. 20 de novembro de 2018, 15:15 UTC. 24 de abril de 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
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