MICROARRAYS DE DNA: PROCEDIMENTO E APLICAÇÕES - BIOLOGIA - 2025

Um microarray de DNA, também chamado de chip de DNA ou microarray de DNA, é composto de uma série de fragmentos de DNA ancorados a um suporte físico de material variável, seja plástico ou vidro. Cada pedaço de DNA representa uma sequência complementar a um gene específico.

O objetivo principal dos microarrays é o estudo comparativo da expressão de determinados genes de interesse. Por exemplo, é comum que essa técnica seja aplicada a duas amostras - uma saudável e outra patológica - para identificar quais genes estão sendo expressos e quais não estão na amostra com a doença. A referida amostra pode ser uma célula ou um tecido.

Por Paphrag na Wikipédia em inglês (Transferido de en.wikipedia para o Commons.), Via Wikimedia Commons

Geralmente, a expressão de genes pode ser detectada e quantificada graças ao uso de moléculas fluorescentes. A manipulação dos chips é realizada na maioria dos casos por robôs e um grande número de genes podem ser analisados ​​simultaneamente.

Esta nova tecnologia é útil para uma ampla gama de disciplinas, desde diagnósticos médicos a vários estudos de biologia molecular nas áreas de proteômica e genômica.

Em que consiste?

Microarrays de DNA (ácido desoxirribonucléico) são um conjunto de segmentos de DNA específicos anexados a uma matriz sólida. Essas sequências são complementares aos genes que querem ser estudados e podem ter até 10.000 genes por cm ².

Essas características permitem o estudo sistemático e massivo da expressão gênica de um organismo.

As informações de que uma célula precisa para funcionar são codificadas em unidades chamadas “genes”. Certos genes contêm as instruções para a criação de moléculas biológicas essenciais chamadas proteínas.

Um gene é expresso se seu DNA for transcrito em uma molécula de RNA mensageiro intermediário e a expressão do gene pode variar dependendo do nível de transcrição desse segmento de DNA. Em certos casos, a mudança na expressão pode ser indicativa de doenças.

O princípio da hibridização torna possível a operação de microarrays. O DNA é uma molécula composta por quatro tipos de nucleotídeos: adenina, timina, guanina e citosina.

Para formar a estrutura de dupla hélice, a adenina agrupa-se com a timina e a citosina com a guanina. Assim, duas cadeias complementares podem ser unidas por ligações de hidrogênio.

Tipos de microarrays

Em termos de estrutura dos microarrays, existem duas variações: o DNA complementar personalizado ou oligonucleotídeos, e os microarrays comerciais de alta densidade fabricados por empresas comerciais, como Affymetrix GeneChip.

O primeiro tipo de microarray permite a análise de RNA de duas amostras diferentes em um único chip, enquanto a segunda variação é do tipo comercial e possui um grande número de genes (por exemplo, o Affymetrix GeneChip possui cerca de 12.000 genes humanos) permitindo analisar uma única amostra.

Processo

Isolamento de RNA

O primeiro passo na condução de um experimento usando a tecnologia de microarray é o isolamento e purificação das moléculas de RNA (pode ser RNA mensageiro ou outros tipos de RNA).

Se você deseja comparar duas amostras (saudável x doente, controle x tratamento, entre outras), deve-se fazer o isolamento da molécula em ambos os tecidos.

Produção e rotulagem de cDNA

Posteriormente, o RNA é submetido a um processo de transcrição reversa na presença de nucleotídeos marcados e assim o DNA complementar ou cDNA será obtido.

O rótulo pode ser fluorescente e deve ser distinguível entre os dois tecidos a serem analisados. Tradicionalmente, são utilizados os compostos fluorescentes Cy3 e Cy5, pois emitem fluorescência em diferentes comprimentos de onda. No caso de Cy3, é uma cor próxima ao vermelho e Cy5 corresponde ao espectro entre laranja e amarelo.

Hibridização

Os cDNAs são misturados e incubados no microarray de DNA para permitir a hibridização (isto é, ocorre a ligação) do cDNA de ambas as amostras com a porção de DNA imobilizada na superfície sólida do microarray.

Uma maior porcentagem de hibridização com a sonda no microarray é interpretada como uma maior expressão no tecido do mRNA correspondente.

Leitura do sistema

A quantificação da expressão é realizada por meio da incorporação de um sistema leitor que atribui um código de cores à quantidade de fluorescência emitida por cada cDNA. Por exemplo, se o vermelho é usado para marcar a condição patológica e hibridiza em maior proporção, o componente vermelho será o predominante.

Com este sistema, a superexpressão ou repressão de cada gene analisado nas duas condições selecionadas pode ser conhecida. Em outras palavras, o transcriptoma das amostras avaliadas no experimento pode ser conhecido.

Larssono, do Wikimedia Commons

Formulários

Atualmente, os microarrays são considerados ferramentas muito poderosas na área médica. Essa nova tecnologia permite o diagnóstico de doenças e um melhor entendimento de como a expressão gênica é modificada em diferentes condições médicas.

Além disso, permite comparar um tecido controle e um tecido tratado com determinado medicamento, a fim de estudar os efeitos de um possível tratamento médico.

Para fazer isso, o estado normal e o estado de doença são comparados antes e depois da administração do medicamento. Ao estudar o efeito da droga no genoma in vivo, temos uma melhor visão geral de seu mecanismo de ação. Além disso, pode-se entender por que alguns medicamentos específicos levam a efeitos colaterais indesejados.

Câncer

O câncer está no topo da lista de doenças estudadas com microarrays de DNA. Essa metodologia tem sido utilizada para a classificação e prognóstico da doença, principalmente nos casos de leucemias.

O campo de investigação dessa condição envolve a compressão e caracterização das bases moleculares das células cancerosas para encontrar padrões de expressão gênica que resultem em falhas na regulação do ciclo celular e nos processos de morte celular (ou apoptose).

Outras doenças

Por meio do uso de microarrays, foi possível elucidar os perfis de expressão diferencial de genes em condições médicas de alergias, imunodeficiências primárias, doenças autoimunes (como artrite reumatoide) e doenças infecciosas.

Referências

1. Bednar, M. (2000). Tecnologia e aplicação de microarray de DNA. Medical Science Monitor, 6 (4), MT796-MT800.
2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS,… & Gullans, SR (2001). Análise de microarranjos de DNA de processos biológicos complexos. Journal of the American Society of Nephrology, 12 (5), 1072-1078.
3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, RJ (2002). Experimentos de microarray de DNA: aspectos biológicos e tecnológicos. Biometrics, 58 (4), 701-717.
4. Plous, CV (2007). Microarrays de DNA e suas aplicações na pesquisa biomédica. Revista CENIC. Biological Sciences, 38 (2), 132-135.
5. Wiltgen, M., & Tilz, GP (2007). Análise de microarranjos de DNA: princípios e impacto clínico. Hematology, 12 (4), 271-287.