COLORAÇÃO DO ESPORO: JUSTIFICATIVA, TÉCNICAS E USOS - BIOLOGIA - 2024

A coloração de esporos é a metodologia utilizada para colorir as estruturas de resistência que formam alguns gêneros bacterianos quando em condições desfavoráveis; Essas estruturas correspondem a uma forma de sobrevivência.

Existem muitos gêneros que formam esporos; entretanto, os principais são Bacillus e Clostridium. Esses gêneros são considerados mais relevantes por apresentarem espécies patogênicas para o homem.

Coloração de esporos pelo método Shaeffer - Fulton ou Wirtz-Conklin. E tambe (uploader original), do Wikimedia Commons

Cada bacilo pode dar origem a um esporo. No momento da coloração da preparação, o esporo pode ser encontrado dentro do bacilo (endosporo) ou fora dele (exosporo). Com as técnicas convencionais de coloração para bactérias - como a coloração de Gram - os esporos permanecem incolores.

Atualmente, existem várias metodologias de coloração que são capazes de penetrar na estrutura espessa do esporo para tingi-lo. Essas metodologias são muito variadas; Entre eles estão a técnica Dorner, a coloração Möeller e a metodologia Shaeffer-Fulton, também conhecida como Wirtz-Conklin.

De todas as técnicas mencionadas, a metodologia Shaeffer-Fulton é a mais utilizada em laboratórios de rotina. Tem o nome de dois microbiologistas que criaram a coloração em 1930: Alicia Shaeffer e MacDonald Fulton. No entanto, a técnica às vezes é chamada de Wirtz-Conklin em homenagem a dois bacteriologistas do século XX.

Base

Os esporos não se coram com as manchas convencionais porque têm uma parede muito espessa. A complexa composição dos esporos impede a entrada da maioria dos corantes.

Se o esporo é estudado de fora para dentro, as seguintes camadas são observadas: primeiro, há o exosporium, que é a camada mais fina e externa formada por glicoproteínas.

Em seguida, vem a cutícula, que oferece resistência a altas temperaturas, seguida pelo córtex composto por peptidoglicano. Depois é a parede da base que protege o protoplasto.

O esporo é uma estrutura desidratada que contém 15% de cálcio e ácido dipicolínico. Portanto, a maioria das técnicas de coloração de esporos dependem da aplicação de calor para que o corante possa penetrar na estrutura espessa.

Uma vez que o esporo é manchado, ele não pode remover o corante. Na técnica de Shaeffer-Fulton, o verde malaquita entra nas células vegetativas e, quando o calor é aplicado, penetra tanto no endosporo quanto nos exosporos.

Ao lavar com água, o corante é removido da célula vegetativa. Isso ocorre porque o corante verde malaquita é ligeiramente básico, por isso se liga fracamente à célula vegetativa.

Em vez disso, ele não pode sair do esporo e, eventualmente, o bacilo é contrastado com safranina. Esse fundamento é válido para o restante das técnicas, nas quais algo semelhante acontece.

Técnicas de coloração de esporos

Para realizar a coloração de esporos, uma cultura pura da cepa suspeita a ser estudada deve ser obtida.

A cultura é submetida a temperaturas extremas por 24 horas para estimular a esporulação do microrganismo. Para isso, a cultura pode ser levada à estufa a 44 ° C ou à geladeira (8 ° C) por 24 ou 48 horas.

Se permanecer muito tempo nas temperaturas mencionadas, apenas exosporos serão observados, uma vez que todos os endosporos já terão saído do bacilo.

Ao final do tempo, algumas gotas de solução fisiológica estéril devem ser colocadas em uma lâmina limpa. Em seguida, uma pequena porção da cultura é colhida e uma boa distribuição é feita.

Em seguida, é deixado secar, fixado no calor e tingido com uma das técnicas explicadas a seguir:

Técnica Dorner

1- Preparar em tubo de ensaio uma suspensão concentrada do microrganismo esporulado em água destilada e adicionar igual volume de carbol-fucsina Kinyoun filtrada.

2- Coloque o tubo em uma banheira com água fervente por 5 a 10 minutos.

3- Em uma lâmina limpa, misture uma gota da suspensão anterior com uma gota de solução aquosa de nigrosina a 10% fervida e filtrada.

4- Espalhe e seque rapidamente com calor suave.

5- Examine com objetiva 100X (imersão).

Os esporos ficam vermelhos e as células bacterianas parecem quase incolores contra um fundo cinza escuro.

Técnica Dorner Modificada

1- Uma suspensão do microrganismo esporulado é espalhada em uma lâmina e fixada no calor.

2- A amostra é coberta com uma tira de papel de filtro à qual é adicionado carbol fucsina. O corante é aquecido por 5 a 7 minutos com a chama do bico de Bunsen até a formação dos vapores. Em seguida, o papel é removido.

3- A preparação é lavada com água e a seguir seca com papel absorvente.

4- Cubra o esfregaço com uma película fina de nigrosina a 10%, utilizando uma segunda lâmina para espalhar a nigrosina ou uma agulha.

A coloração obtida pelos esporos e bactérias é a mesma que a descrita na técnica anterior.

Shaeffer - técnica de Fulton ou Wirtz-Conklin

1- Faça um esfregaço fino com uma suspensão do microrganismo esporulado em uma lâmina e fixe ao calor.

2- Cubra a lâmina com solução aquosa de verde malaquita a 5% (você pode colocar um papel de filtro na lâmina).

3- Aquecer sobre a chama do bico de Bunsen para provocar a liberação de vapores e remover a chama. Repita a operação por 6 a 10 minutos. Se a solução de verde malaquita evaporar muito durante o procedimento, mais pode ser adicionado.

4- Retire o papel de filtro (se instalado) e lave com água.

5- Cubra a lâmina com safranina aquosa 0,5% por 30 segundos (algumas variantes da técnica usam safranina aquosa 0,1% e deixe por 3 minutos).

Com esta técnica, os esporos aparecem verdes e os bacilos vermelhos.

Tem a desvantagem de que os endosporos de culturas jovens não se coram bem, pois parecem extremamente límpidos ou incolores. Para evitar isso, recomenda-se o uso de culturas de 48 horas de incubação.

Técnica Möeller

1- Cubra o esfregaço com clorofórmio por 2 minutos.

2- Descarte o clorofórmio.

3- Cubra com ácido crômico 5% por 5 minutos.

4- Lave com água destilada

5- A folha é recoberta com carbol fucsina-fenicada e fica exposta à chama do bico de Bunsen até a emissão dos vapores; em seguida, é removido da chama por alguns momentos. A operação é repetida até que 10 minutos sejam concluídos.

6- Lave com água.

7- Use etanol acidificado (álcool clorídrico) para descolorir. É deixado por 20 ou 30 segundos.

8- Lave com água destilada.

9- Contrastar cobrindo a folha com azul de metileno por 5 minutos.

10- Lave com água destilada.

11- Deixe secar e a amostra é levada ao microscópio.

Os esporos aparecem vermelhos e os bacilos azuis. É importante não respirar os vapores, pois são tóxicos e, a longo prazo, podem ser cancerígenos.

Técnica Möeller modificada sem calor

Em 2007, Hayama e seus colaboradores criaram uma modificação da técnica Möeller. Eles eliminaram a etapa de aquecimento do corante e o substituíram adicionando 2 gotas do surfactante Tergitol 7 para cada 10 ml de solução de carbol fucsina-carbol. Os mesmos resultados foram obtidos.

Formulários

A coloração dos esporos fornece informações muito valiosas e úteis para a identificação do patógeno, visto que sua presença, sua forma, localização dentro do bacilo e a capacidade de deformar ou não a célula vegetativa, são dados que podem nortear a espécie. envolvidos dentro de um determinado gênero.

Neste contexto, vale dizer que os esporos podem ser redondos ou ovais, podem estar localizados no centro ou também em posição paracentral, subminal ou terminal.

Diagrama da forma e posição dos endosporos e exosporos

Exemplos

- Clostridium difficile forma um esporo oval em uma posição terminal que deforma o bacilo.

- O esporo de Clostridium tertium é oval, não deforma o bacilo e está localizado no nível terminal.

- O endosporo de Clostridium tetani é terminal e deforma o bacilo, dando a aparência de uma coxa.

- Os esporos de Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy e C. septicum são redondos ou ovais subterminal e deformam o bacilo.

- O endosporo de Clostridium sordelli está localizado na posição central, com uma leve deformação.

Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA

Referências

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Proposta de uma técnica simplificada para a coloração de esporos bacterianos sem aplicação de calor - modificação bem-sucedida do método de Moeller. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Colaboradores da Wikipedia. Mancha de Moeller. Wikipédia, a enciclopédia livre. 3 de novembro de 2018, 03:28 UTC. Disponível em: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Manual do Laboratório de Técnicas Microbiológicas. Departamento de Ciências Básicas da Academia de Microbiologia. Instituto Politécnico Nacional.
4. "Endosporo." Wikipédia, a enciclopédia livre. 25 de fevereiro de 2018, 10:20 UTC. 10 de janeiro de 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J e colaboradores. (2006). Pessoal de Trabalho da Comunidade Autônoma de Extremadura. Agenda específica Volume IV. Editorial MAD. Sevilha-Espanha, pp 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006) Técnico de laboratório especializado, Serviço de Saúde Galego (SERGAS). Agenda de assuntos específicos volume 2. Editorial MAD. Sevilha-Espanha, pp 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA