HISTOQUÍMICA: JUSTIFICATIVA, PROCESSAMENTO, COLORAÇÃO - BIOLOGIA - 2024

A histoquímica é uma ferramenta útil no estudo da morfologia de diversos tecidos biológicos (plantas e animais) devido ao seu princípio de reação de componentes teciduais como carboidratos, lipídios e proteínas, entre outros, corantes químicos.

Esta valiosa ferramenta permite não só identificar a composição e estrutura dos tecidos e células, mas também as várias reações que neles ocorrem. Da mesma forma, podem ser evidenciados possíveis danos aos tecidos causados ​​pela presença de microrganismos ou outras patologias.

Colorações histoquímicas. Vírus do Nilo, bactérias Gram positivas e Gram negativas (Gram), Histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Fonte: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

A histoquímica, dos séculos passados, forneceu contribuições importantes, como a demonstração da existência da barreira hematoencefálica por Paul Ehrlich. Isso foi possível porque o cérebro do animal experimental usado por Ehrlich não foi corado com anilina, que é um corante básico.

Isso levou ao uso de vários corantes, como azul de metileno e indofenol, para corar os diferentes tipos de células. Esse achado levou à classificação das células em acidofílicas, basofílicas e neutrofílicas, de acordo com sua coloração específica.

Estudos recentes têm aplicado essa técnica para mostrar a presença de vários compostos, incluindo fenóis, bem como carboidratos e lipídios não estruturais, nos tecidos da espécie Litsea glaucescens, mais conhecida como louro. Encontrar estes, tanto na folha como na madeira.

Da mesma forma, Colares et al, 2016, identificaram a planta de interesse medicinal Tarenaya hassleriana, utilizando técnicas histoquímicas. Nesta espécie foi evidenciada a presença de amido, mirosina, além de compostos fenólicos e lipofílicos.

Base

A histoquímica é baseada na coloração de estruturas celulares ou moléculas presentes nos tecidos, graças à sua afinidade com corantes específicos. A reação de coloração dessas estruturas ou moléculas, em seu formato original, é posteriormente visualizada em microscópio óptico ou eletrônico.

A especificidade da coloração deve-se à presença de grupos de aceitação de íons presentes nas células ou moléculas de tecido.

Finalmente, o objetivo das reações histoquímicas é ser capaz de demonstrá-lo por meio de coloração. Desde as maiores estruturas biológicas até os menores tecidos e células. Isso pode ser conseguido graças ao fato de que os corantes reagem quimicamente com as moléculas dos tecidos, células ou organelas.

Acusação

A reação histoquímica pode envolver etapas anteriores à realização da técnica, como fixação, incorporação e corte do tecido. Portanto, deve-se levar em consideração que nestas etapas a estrutura a ser identificada pode ser danificada, gerando resultados falsos negativos, mesmo que presente.

Apesar disso, a fixação prévia do tecido realizada de maneira adequada é importante, pois evita a autólise ou destruição celular. Para isso, são utilizadas reações químicas com solventes orgânicos como: formaldeído ou glutaraldeído, entre outros.

A inclusão do tecido é feita de forma que mantenha sua firmeza no corte e assim evite deformar. Por fim, o corte é feito com um micrótomo para estudo de amostras por microscopia óptica.

Além disso, antes de prosseguir com a coloração histoquímica, é recomendável incorporar controles positivos externos ou internos em cada lote de testes. Bem como a utilização de corantes específicos para as estruturas a serem estudadas.

Manchas histoquímicas

Desde o surgimento das técnicas histoquímicas até o presente, uma ampla gama de colorações tem sido usada, incluindo as mais frequentemente utilizadas, como: ácido periódico de Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen e Gram.

Da mesma forma, outros corantes têm sido usados ​​com menos frequência, como nanquim, orceína ou corante tricrômico de Masson, entre outros.

Ácido Periódico Schiff (PAS)

Com essa coloração, podem ser observadas moléculas com alto teor de carboidratos, como: glicogênio e mucina. No entanto, também é útil para a identificação de microrganismos, como fungos e parasitas. Além de certas estruturas (membrana basal) na pele e em outros tecidos.

A base para essa coloração é que o corante oxida as ligações de carbono entre dois grupos hidroxila próximos. Isso produz a liberação do grupo aldeído, que é detectado pelo reagente de Schiff, emitindo uma cor roxa.

O reagente de Schiff é composto por fucsina básica, metabissulfito de sódio e ácido clorídrico, sendo esses componentes responsáveis ​​pela coloração roxa, quando presentes grupos aldeídos. Caso contrário, um ácido incolor é gerado.

A intensidade da coloração dependerá da quantidade de grupos hidroxila presentes nos monossacarídeos. Por exemplo, em fungos, membranas basais, mucinas e glicogênio, a cor pode variar de vermelho a roxo, enquanto os núcleos coram de azul.

Grocott

É uma das manchas com maior sensibilidade na identificação de fungos em tecidos incluídos em parafina. Isso permite a identificação das diversas estruturas fúngicas: hifas, esporos, endosporos, entre outros. Portanto, é considerada uma coloração de rotina para o diagnóstico de micose.

É especialmente utilizado no diagnóstico de micoses pulmonares, como pneumocistose e aspergilose, causadas por alguns fungos dos gêneros Pneumocystis e Aspergillus, respectivamente.

Esta solução contém nitrato de prata e ácido crômico, sendo este último um fixador e corante. O raciocínio é que esse ácido produz a oxidação de grupos hidroxila a aldeídos por mucopoliacáridos presentes em estruturas fúngicas, por exemplo, na parede celular de fungos.

Por fim, a prata presente na solução é oxidada pelos aldeídos, causando uma coloração preta, que é chamada de reação argentafina. Também podem ser usados ​​corantes de contraste como o verde claro e, assim, as estruturas fúngicas serão observadas em preto com fundo verde claro.

Ziehl-Neelsen

Essa coloração é baseada na presença de resistência ao álcool-ácido, parcial ou totalmente, em alguns microrganismos, como os gêneros Nocardia, Legionella e Mycobacterium.

O uso desse corante é recomendado, pois a parede celular dos microrganismos citados anteriormente contém lipídios complexos que dificultam a penetração dos corantes. Principalmente em amostras do trato respiratório.

Nele são usados ​​corantes fortes como carbol fucsina (corante básico) e é aplicado calor para que o microrganismo retenha o corante e não descolorir com ácidos e álcoois. Finalmente, uma solução de azul de metileno é aplicada para colorir as estruturas que ficaram descoloridas.

A presença de resistência ao álcool-ácido é observada nas estruturas coradas de vermelho, enquanto as estruturas que não resistem ao desbotamento são coradas de azul.

Gram e tinta chinesa

O Gram é uma coloração muito útil no diagnóstico de infecções bacterianas e fúngicas, entre outras. Essa coloração permite a diferenciação entre microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, mostrando claramente as diferenças que existem na composição da parede celular.

Já a tinta nanquim é uma mancha usada para contrastar estruturas que contêm polissacarídeos (cápsula). Isso porque um anel se forma no ambiente, sendo possível em Cryptococcus neoformans.

Orcein

Com essa coloração, as fibras elásticas e os cromossomos de várias células são coloridos, permitindo a avaliação do processo de maturação destas. Por esse motivo, tem sido muito útil em estudos citogenéticos.

Isso se baseia na captação do corante pela carga negativa de moléculas como o DNA, presentes no núcleo de uma grande variedade de células. Portanto, estes são tingidos de azul a roxo escuro.

Tricrômico de Masson

Esta mancha é usada para identificar alguns microorganismos ou materiais que contêm pigmentos melânicos. É o caso das micoses, causadas por fungos demáceos, feohifomicose e no eumicetoma de grão preto.

Pensamentos finais

Nos últimos anos, houve muitos avanços na criação de novas técnicas de diagnóstico, onde a histoquímica está envolvida, mas ligada a outros fundamentos ou princípios. Essas técnicas têm um propósito diferente, como no caso da imunohistoquímica ou da enzimo-histoquímica.

Referências

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