SIMMONS CITRATE AGAR: JUSTIFICATIVA, PREPARAÇÃO E USO - BIOLOGIA - 2024

O ágar Simmons citrato é um meio sólido utilizado como teste de identificação bioquímica de microrganismos, principalmente bacilos gram - negativos. O meio original foi criado por Koser em 1923.

O meio de citrato de Koser consistia em um caldo contendo fosfato de sódio, fosfato de amônio, fosfato monopotássico, sulfato de magnésio e citrato de sódio.

A. Meio comercial de Simmons Citrate Agar desidratado B. Prepared Simmons Citrate Agar. Fonte: A. Foto tirada por MSc. Marielsa Gil B. Roto2esdios, do Wikimedia Commons

Como pode ser visto, a única fonte de carbono do meio é o citrato, e de nitrogênio é o fosfato de amônio, omitindo proteínas e carboidratos como fonte desses elementos, comumente presentes em outros meios.

Portanto, a bactéria inoculada neste meio só pode se reproduzir se for capaz de absorver o carbono do citrato. O teste era positivo se houvesse turbidez no meio, porém tinha a desvantagem de poder ocorrer turbidez não específica.

Este problema foi resolvido por Simmons adicionando azul de bromotimol e ágar à fórmula original de Koser. Embora o princípio seja o mesmo, ele é interpretado de forma diferente.

Base

Algumas bactérias têm a capacidade de sobreviver na ausência de fermentação ou produção de ácido lático, necessitando obter energia por meio da utilização de outros substratos. Neste teste, a única fonte de carbono oferecida é o citrato.

As bactérias que conseguem sobreviver nessas condições metabolizam rapidamente o citrato em uma alternativa à rota tradicional, usando o ciclo do ácido tricarboxílico ou o ciclo de fermentação do citrato.

O catabolismo do citrato pelas bactérias envolve um mecanismo enzimático sem a intervenção da coenzima A. Esta enzima é conhecida pelo nome de citricase (citrato oxaloacetato-liase) ou citrato desmolase. A reação requer a presença de um cátion divalente, que nesse caso é fornecido pelo magnésio.

A reação gera oxaloacetato e piruvato, que dão origem a ácidos orgânicos em meio a um pH alcalino formado pelo uso da fonte de nitrogênio. Esses ácidos orgânicos são usados ​​como fonte de carbono, gerando carbonatos e bicarbonatos, alcalinizando ainda mais o meio ambiente.

Modo de semeadura

O meio de citrato Simmons deve ser inoculado levemente em rabo de peixe usando um laço reto ou agulha e incubado por 24 horas a 35-37 ° C. Após o tempo, os resultados são observados.

A semeadura é feita apenas na superfície do ágar. Não perfure.

Interpretação

Se o meio permanecer com a cor original (verde) e não houver crescimento visível, o teste é negativo, mas se o meio ficar azul, indica a presença de produtos alcalinos, o que é detectado pelo indicador de pH. Neste caso, o teste é positivo.

Citrato (+) e (-). Fonte: MSc. Marielsa gil

Isso porque se a bactéria usar o carbono do citrato também é capaz de tirar o nitrogênio do fosfato de amônio com o qual libera amônia, alcalinizando o meio.

Por outro lado, se for observado crescimento da bactéria no meio, mas não houver mudança de cor, o teste também deve ser considerado positivo, pois se houver crescimento significa que a bactéria conseguiu utilizar o citrato como fonte de carbono, embora não haja nenhuma mudança no pH no momento (às vezes pode levar algum tempo).

Se houver dúvida na interpretação da cor final, ela pode ser comparada a um tubo de citrato não inoculado.

Preparação

Pesar 24,2 g do meio desidratado para um litro de água. Misture e deixe descansar por aproximadamente 5 minutos. Termine de dissolver o meio aquecendo por 1 ou dois minutos, agitando freqüentemente.

Despeje 4 ml em tubos de ensaio e autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Ao sair da autoclave inclinar com o auxílio de um suporte de forma que o ágar se solidifique em forma de bico de flauta com pouco bloco ou fundo e mais bisel.

O pH final do meio citrato é 6,9 (cor verde). Este meio é muito sensível a mudanças no pH.

Em pH 6 ou inferior, o meio fica amarelo. Esta cor não é observada no teste de bactérias.

E em pH 7,6 ou acima, o meio torna-se azul da Prússia profundo.

Usar

O Simmons Citrate Agar é usado para a identificação de certos microrganismos, especialmente bacilos pertencentes à família Enterobacteriaceae e outros bacilos não fermentadores de glicose.

Fonte: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

Pensamentos finais

O meio citrato Simmons é um teste muito delicado, uma vez que podem ser obtidos falsos positivos se forem cometidos alguns erros.

Os cuidados que devem ser tomados são os seguintes:

Inóculo

Não deve ser feito um inóculo bacteriano muito espesso ou carregado, pois pode causar o desenvolvimento de uma coloração amarelo-acobreada no local da semeadura, sem afetar o restante do meio, mas pode levar a crer que haja crescimento. Isso não significa positividade do teste.

Além disso, um inóculo espesso pode gerar um falso positivo, porque os compostos orgânicos pré-formados dentro das paredes celulares das bactérias que morrem podem liberar carbono e nitrogênio suficientes para girar o indicador de pH.

Portanto, o ideal é semear com a agulha em vez do cabo de platina, para não tirar excesso de material.

Semeado

Por outro lado, quando a bateria de testes bioquímicos para identificação do microrganismo em questão está sendo semeada, é importante que o teste do citrato seja o primeiro a ser inoculado, para evitar o transporte de proteínas ou carboidratos de outro meio.

Nessas circunstâncias, é possível obter um falso positivo, pois qualquer uma dessas substâncias introduzidas por engano será metabolizada e provocará alteração do pH.

Outra forma de evitar o transporte de substâncias é queimar bem a alça e fazer um novo inóculo entre um teste e outro.

Deve-se ter cuidado também ao tocar a colônia para a realização do inóculo, pois deve-se evitar arrastar parte do ágar da cultura de onde provém a bactéria, devido ao exposto acima.

Nesse sentido, Matsen, Sherris e Branson recomendam diluir o inóculo em solução fisiológica antes de inocular o teste de citrato para evitar a transferência de outras fontes de carbono.

Intensidade da cor

Deve-se levar em consideração que a intensidade da cor produzida quando o teste é positivo pode variar de acordo com a casa comercial.

Além disso, existem microrganismos que apresentam resultado positivo em 24 horas, mas existem outras cepas que requerem 48 horas ou mais para produzir uma mudança no pH.

Referências

1. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial Panamericana. Bons ares. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
4. Laboratórios BD. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015. Disponível em: bd.com
5. Britannia Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2015. Disponível em: britanialab.com
6. Valtek Diagnostic Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2016. Disponível em: andinamedica.com.