AGAR MÜELLER HINTON: BASE, PREPARAÇÃO E USOS - BIOLOGIA - 2024

O Ágar Mueller Hinton não é seletivo, o meio nutriente sólido é composto por infusão de carne, caseína ácida peptona, amido, ágar e água destilada. Este meio permite um excelente crescimento microbiano para a maioria das bactérias de crescimento rápido.

Foi originalmente criado por John Howard Müeller e Jane Hinton para isolar bactérias que demandam nutrição, como Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. Porém, por suas características, revelou-se ideal para o estudo da suscetibilidade aos antibióticos, proporcionando resultados confiáveis ​​e reprodutíveis.

Antibiogramas (ágar Müeller Hinton). Fonte: Dr. Graham Beards em en.wikipedia

Portanto, o ágar Müeller Hinton é o meio de cultura aceito pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e pelo European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, para a realização do teste de susceptibilidade antimicrobiana pelo método de difusão em disco de Kirby e Bauer.

Base

Por ser um meio nutritivo não seletivo, é excelente para o crescimento da maioria das bactérias patogênicas.

Por outro lado, sua composição simples torna as substâncias facilmente difusas sobre ele, sendo uma característica essencial para o teste de susceptibilidade pelo método de difusão em disco.

Outra de suas características é o baixo teor de inibidores, o que permite que sulfonamidas, trimetoprima e tetraciclinas sejam avaliados de forma eficaz.

No entanto, deve-se ter em mente que o meio deve atender a certas condições para garantir seu funcionamento adequado, incluindo:

O ajuste do pH, a profundidade do ágar e a concentração adequada de timina, timidina, Ca ⁺⁺, Mg ⁺⁺ e Zn ⁺⁺.

Você também deve saber que a metodologia é padronizada e, portanto, todos os parâmetros devem ser atendidos, tais como:

A concentração do inóculo, a concentração e conservação dos discos de antibióticos, a colocação do número apropriado de discos no ágar, a distância entre um disco e outro, a colocação estratégica de certos antibióticos, a atmosfera, a temperatura e o tempo de incubação.

Preparação

Pesar 37 g de meio Müeller Hinton desidratado e dissolver em 1 litro de água destilada. Aqueça o meio enquanto agita para ajudar na dissolução. Ferva por 1 minuto.

Autoclave para esterilizar a 121 ° C por 15 minutos. Ao retirar da autoclave, o frasco deve ser colocado em banho-maria a 50 ° C para esfriar. Despeje 25 a 30 ml em placas de Petri estéreis de 10 cm de diâmetro.

As placas devem ter espessura média de 4 mm (ideal), sendo permitido um intervalo de 3 a 5 mm.

Se for desejado preparar ágar sangue usando ágar Müeller Hinton como base, despeje 5% de sangue de cordeiro estéril e desfibrinado antes de servir nas placas.

O pH final do meio deve estar entre 7,2 a 7,4.

Invista e guarde na geladeira, até o uso. Deixe a placa atingir a temperatura ambiente antes de usar.

A cor do meio preparado é bege claro.

Formulários

É usado para realizar o antibiograma ou teste de sensibilidade aos antibióticos para a maioria dos patógenos não exigentes de crescimento rápido.

Se o ágar for suplementado com sangue, é utilizado para a realização do antibiograma de microrganismos exigentes como: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, entre outros. Também tem sido usado para isolar Legionella pneumophila.

Técnica de antibiograma

Antes de realizar o antibiograma, deve-se preparar uma solução bacteriana equivalente a 1,5 x 10 ⁸ células.

Para isso, 3 a 4 colônias da cultura pura são retiradas e suspensas em caldo de tripticase de soja ou em caldo Müeller Hinton, incubadas por 2 a 6 horas e a concentração ajustada com soro fisiológico estéril, comparando-a com um padrão Mac Farland de 0,5%.

Se forem microorganismos exigentes, as colônias podem ser suspensas diretamente até uma concentração de 0,5% Mac Farland. Posteriormente, a placa de Müeller Hinton é semeada com um swab impregnado com a solução bacteriana preparada.

Para isso, o swab é imerso na solução e o excesso de líquido é removido pressionando-se contra as paredes do tubo. Em seguida, o swab é passado por toda a superfície, não deixando nenhum lugar intocado, então a placa é ligeiramente girada e semeado novamente. A operação é repetida mais 2 vezes.

Deixe repousar por 10 minutos e insira os discos de antibiótico com uma pinça estéril, deixando um espaço de 24 mm entre eles. Depois de colocar cada disco no ágar, pressione cada disco levemente com a pinça para garantir que eles aderem bem.

Terminado o processo, a placa é invertida e incubada a 35-37 ° C em aerobiose por 16 a 18 horas. Se for um microrganismo exigente, pode merecer microaerofilia e se o antibiograma contiver discos de oxacilina, deve ser lido após 24 horas.

Uma régua é usada para medir o diâmetro de cada halo. Os resultados devem ser registrados em mm. Posteriormente, os valores obtidos são correlacionados com as tabelas de pontos de corte publicadas pelo atual manual do CLSI.

Medição do halo de inibição. Fonte: USCDCP, Pixnio.com

Reportar como sensível (S), intermediário (I) ou resistente (R), conforme o caso.

Os antibióticos são selecionados de acordo com o microrganismo isolado e o tipo de infecção que ele está produzindo.

Às vezes, a localização estratégica de antibióticos deve ser mantida em mente para revelar padrões fenotípicos de resistência.

Posicionamento estratégico do disco em ágar Müeller Hinton

Para enterobactérias, o disco de ácido clavulânico deve ser colocado contra as cefalosporinas de 3ª e 4ª geração. Um alargamento em forma de ovo indica que a cepa é produtora de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL). Isso significa que o paciente não deve ser tratado com cefalosporinas.

Expressão fenotípica da produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) em uma cepa de Escherichia coli. Fonte: Foto tirada pelo autor MSc. Marielsa gil

No Staphylococcus é importante colocar o disco de eritromicina ou azitromicina na frente do disco de clindamicina (teste D).

Um halo resistente na eritromicina e um achatamento no halo clindamicina indica que a cepa possui resistência à clindamicina induzível por cepa (ICR). Isso significa que um tratamento com clindamicina não será eficaz.

Para pesquisar cepas de AMP C induzíveis em Enterobacteriaceae e alguns bastonetes Gram negativos não fermentadores, os discos de tazobactan ceftazidima, cefoxitina ou piperacilina são voltados para um disco imipenem, a uma distância de 27 mm.

Um halo achatado em um dos discos voltados para o imipenem indica a presença de AMP C induzível.

Para a busca do C-AMP constitutivo, um disco de cloxacilina de 500 µg é confrontado com ceftazidima (30 µg) e cefotaxima (30 µg), a uma distância de 25 mm. Um halo alargado em qualquer uma das cefalosporinas indica positividade.

O disco de cloxacilina também pode ser substituído por um disco de 9 mm de papel de filtro Whatman No. 6 impregnado com ácido fenil bórico (400 µg) com uma distância de 18 mm. É interpretado da mesma forma que o anterior.

Finalmente, para investigar a produção de metalobetalactamases especialmente em Pseudomonas aeruginosa, utiliza-se um disco impregnado com 10 µl de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA 750 µg) e ácido tioglicólico (SMA 300 µg), que é confrontado com os discos de imipenem e meropenem, a uma distância de 15 mm.

O teste é positivo se houver alargamento dos halos do imipenem ou meropenem em direção ao disco EDTA / SMA. Este resultado deve ser confirmado pelo teste de Hodge modificado.

Este método consiste em inocular uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na placa Müeller Hinton. Um disco imipenem é colocado no centro da placa e, em seguida, uma linha é feita do disco para a periferia com a cepa suspeita de P. aeruginosa. Até 4 cepas podem ser testadas por placa.

O teste será positivo se houver zona de distorção do halo imipenem ao redor da estria.

Causas de resultados errados

- Discos de antibióticos mal preservados podem produzir falsa resistência. Por exemplo, o disco de oxacilina é muito vulnerável a mudanças de temperatura.

-Um pH do meio abaixo do indicado (ácido) produz halos menores em aminoglicosídeos e macrolídeos (risco de falsa resistência), e halos maiores em penicilina, tetraciclina e novobiocina (risco de falsa sensibilidade).

-Se o pH estiver acima do indicado (alcalino) os efeitos descritos acima são revertidos.

-Médios com altas concentrações de timina e timidina têm influência, reduzindo significativamente os halos de inibição das sulfonamidas e trimetoprim.

-Altas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsa resistência de aminoglicosídeos, polimixina B e tetraciclinas contra cepas de Pseudomonas aeruginosa.

- Baixas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsas sensibilidades de aminoglicosídeos, polimixina B e tetraciclinas contra cepas de Pseudomonas aeruginosa.

-A presença de zinco afeta os resultados dos discos de carbapenem (imipenem, meropenem e ertapenem).

- Espessura do meio abaixo de 3 mm produzirá resultados de falsa sensibilidade, enquanto espessura acima de 5 produzirá falsa resistência.

-A mobilização dos discos no antibiograma dará halos deformados, já que a descarga do antibiótico é imediata.

- Inóculos muito fracos afetam os resultados, pois não haverá um crescimento uniforme ou confluente no ágar, condição necessária para poder medir os halos de inibição, além do fato de que os halos podem dar maiores que o normal.

- Inóculos excessivamente carregados podem dar halos menores que o normal.

-Não respeitar a distância entre os discos faz com que um halo se sobreponha a outro e não pode ser lido corretamente.

-Incubar com CO ₂ aumenta o tamanho dos halos dos discos de tetraciclina e meticilina.

-Incubar em temperaturas abaixo de 35 ° C produz halos maiores.

-A adição de sangue diminui o tamanho do halo sulfa.

Limitação

A sensibilidade de um antibiótico demonstrada no antibiograma contra um microrganismo (in vitro) não é uma garantia de que funcionará in vivo.

Controle de qualidade

Para saber se o meio contém a quantidade adequada de timina, uma cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 deve ser plantada e a suscetibilidade ao sulfametoxazol trimetoprim (SXT) deve ser testada, deve dar um halo igual ou> 20 mm para ser satisfatória.

Referências

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