AGAR TSI: JUSTIFICATIVA, PREPARAÇÃO E USOS - BIOLOGIA - 2024

O ágar TSI ou ágar ferro-açúcar triplo é um meio sólido que serve como um teste bioquímico para orientar a identificação inicial de bacilos Gram negativos. Baseia-se em mostrar a fermentação dos açúcares presentes e a produção de sulfeto de hidrogênio e gás.

Sua composição e base são muito semelhantes às do teste de ferro de Kligler, com a diferença de que este contém apenas glicose e lactose. Em vez disso, como o nome indica, o ágar de ferro e açúcar triplo contém três carboidratos fermentáveis: glicose, lactose e sacarose.

Imagens do teste TSI com diferentes microrganismos A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Fonte: Witmadrid, do Wikimedia Commons

Além disso, o meio TSI possui quatro derivados de proteína que o tornam um ágar muito nutritivo: extrato de levedura, extrato de carne, peptona e peptona proteose. Ele também contém sulfato de amônio ferroso, tiossulfato de sódio, cloreto de sódio, vermelho de fenol e ágar.

A incapacidade de um microrganismo de fermentar a glicose presente no meio o exclui imediatamente de pertencer à família Enterobacteriaceae. Portanto, este teste é essencial para decidir qual rota de identificação seguir para determinar o gênero e a espécie.

Cada laboratório decide se trabalhará com ágar TSI ou ágar de ferro Kligler.

Base

Cada um dos compostos cumpre uma função dentro do meio.

Cloreto de sódio e ágar

O cloreto de sódio é necessário para manter o equilíbrio osmótico do meio. Enquanto o ágar dá a consistência sólida.

Indicador de pH (vermelho de fenol)

O pH do meio preparado é equilibrado em 7,3 e o indicador de pH (vermelho de fenol) fica amarelo abaixo de 6,8. Isso significa que pequenas quantidades de ácidos produzidos pela fermentação de açúcares transformarão o meio de vermelho-laranja em amarelo.

Se não ocorrer fermentação, haverá alcalinização do meio através do uso de peptonas, passando de vermelho-laranja para vermelho forte.

Derivados de proteína (extrato de levedura, extrato de carne, peptona e peptona de proteose)

Quando a bactéria metaboliza as proteínas presentes no ágar TSI, são produzidas aminas que alcalinizam o meio (principalmente no nível de bisel), pois a reação requer oxigênio. As aminas tornam a moldura vermelha brilhante.

Mas isso vai depender da capacidade da bactéria de fermentar carboidratos ou não.

Fermentação de carboidratos (glicose, lactose e sacarose)

O estudo da fermentação dos açúcares pode dar várias imagens e cada uma é interpretada de forma diferente. A interpretação do teste divide os microrganismos em 3 categorias: não fermentadores de glicose, não fermentadores de lactose e fermentadores de lactose / sacarose.

Deve-se observar que a quantidade de glicose no meio é limitada, enquanto a concentração de lactose e sacarose é 10 vezes maior.

As bactérias da família Enterobacteriaceae e outros microrganismos fermentadores de glicose começarão a fermentar esse açúcar, pois é o carboidrato mais simples para obter energia.

Por outro lado, a lactose e a sacarose são carboidratos complexos que devem ser quebrados e convertidos em glicose para que entrem no ciclo de Embden-Meyerhof.

-Microorganismos não fermentam glicose

Quando o microrganismo inoculado é incapaz de fermentar a glicose, muito menos será capaz de fermentar outros carboidratos. Portanto, nenhum ácido é formado aqui, mas há formação de aminas no bisel pelo uso de peptonas.

Neste caso, a moldura fica vermelha mais forte e o fundo do tubo pode permanecer inalterado ou também alcalinizar, deixando todo o tubo vermelho.

Interpretação: K / K significa chanfro alcalino / fundo alcalino ou neutro

Na imagem do início do artigo veja a imagem do tubo D.

Esse resultado indica que o microrganismo não pertence à família Enterobacteriaceae.

-Microorganismos não fermentam lactose / sacarose

Se a bactéria for capaz de fermentar glicose, mas não lactose ou sacarose, acontecerá o seguinte:

A bactéria irá consumir toda a glicose presente após aproximadamente 6 a 8 horas, podendo acidificar tanto o bisel quanto o bloco; isto é, o ágar ficará completamente amarelo. Mas quando a glicose se esgota e a lactose e a sacarose não podem ser usadas, a bactéria iniciará o metabolismo das proteínas.

Esta reação necessita de oxigênio, portanto a degradação das peptonas ocorre na superfície (bisel). As aminas produzidas alcalinizam o aro, passando do amarelo ao vermelho. Esta reação é evidenciada após 18 a 24 horas de incubação.

Interpretação: K / A significa bisel alcalino e pasta ácida.

Na imagem do início do artigo veja a imagem do tubo B.

- Microrganismos fermentadores de lactose / sacarose

Microrganismos capazes de fermentar lactose e sacarose podem obviamente fermentar glicose. Após o esgotamento da quantidade mínima de glicose presente no meio, o piruvato formado começa a se metabolizar em ácidos por meio do ciclo aeróbio de Krebs, sendo que no período de 8 a 12 horas todo o meio ficará amarelo.

Se a bactéria for capaz de quebrar a lactose ou sacarose, os ácidos continuarão a ser produzidos e, após 18 a 24 horas, todo o tubo - bisel e tampão - continuará a amarelar.

Ressalta-se que o uso da glicose é realizado de duas formas: uma aerobicamente no bisel do tubo e outra anaerobicamente no fundo do tubo.

Interpretação: A / A significa chanfro ácido / fundo ácido. Pode ou não ter gás.

Na imagem do início do artigo veja a imagem do tubo A.

Produção de gás

Alguns microrganismos são capazes de produzir gases durante a fermentação de açúcares. O gás é evidenciado no tubo pela pressão que ele exerce dentro do ágar. A pressão causa a formação de bolhas ou o deslocamento do ágar. Às vezes, a formação de gás pode fraturar o meio.

É importante que na hora da semeadura do meio TSI, a punção seja feita de forma limpa através do centro do ágar até atingir o fundo. Se a punção for desviada para as paredes do tubo, pode causar falsos positivos na produção do gás, uma vez que escapará pelo canal mal formado.

A produção de gás, assim como as reações que ocorrem no bisel do ágar, precisam de oxigênio, portanto, recomenda-se que o tubo seja coberto com um tampão de algodão e, se for utilizada uma tampa de baquelite, não deve ser totalmente estanque.

A produção de gás é relatada como positiva (+) ou negativa (-).

Padrões de formação de gás. Fonte: Esquema elaborado por MSc. Marielsa Gil. Fonte da imagem: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, via Wikimedia Commons

Tiossulfato de sódio e sulfato de amônio ferroso

As bactérias capazes de produzir sulfeto de hidrogênio (gás incolor) absorvem o enxofre do tiossulfato de sódio presente no meio. Uma vez que o H ₂ S é formado, ele reage com o sulfato de amônio ferroso, produzindo sulfeto de ferro (precipitado preto claramente visível).

H ₂ produção S é classificado como positivo (+) ou negativa (-).

Na imagem do início do artigo veja a imagem do tubo C.

Preparação

Pesar 62,5 g do meio de ágar triplo açúcar ferro desidratado (TSI) e dissolver em um litro de água destilada.

Aquecer até que o ágar esteja completamente dissolvido. Ferva por um minuto, mexendo sempre. Distribua 4 ml do meio em 13/100 tubos de ensaio com tampas de algodão.

Esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Retire da autoclave e deixe descansar em ângulo. Deve-se ter cuidado para que a base e o painel tenham a mesma distância.

Armazenar em geladeira 2-8 ° C. Deixe aquecer antes de semear a cepa bacteriana.

A cor do meio desidratado é bege claro e o meio preparado é laranja-avermelhado.

O pH final do meio preparado é 7,3 ± 0,2.

Formulários

O teste TSI é amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia. Este teste é fundamental para orientar o tipo de teste que deve ser aplicado para a identificação do gênero e da espécie. Sua boa execução e interpretação podem economizar material e mão de obra.

Se o resultado for um TSI K / K e o teste da citocromo oxidase for positivo, sabe-se que os testes devem ser usados ​​para a identificação de bastonetes Gram negativos não fermentadores, como Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, entre outros gêneros. Se for oxidase negativo, está orientado para os gêneros Acinetobacter, Stenotrophomonas, etc.

Por outro lado, se for obtido TSI A / A ou K / A e o teste da citocromo oxidase for negativo, quanto mais os nitratos se reduzirem a nitritos, teremos a certeza de que se trata de um microrganismo pertencente à família Enterobacteriaceae. Nesse caso, a rota de identificação terá como foco testes específicos para esse grupo de bactérias.

Por outro lado, se for obtida uma imagem K / A ou A / A e o teste da citocromo oxidase for positivo, os testes complementares a serem montados terão como objetivo identificar cepas fermentadoras não pertencentes à Família Enterobacteriaceae, tais como: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio e Pasteurella.

Uma TSI com sulfeto de hidrogênio, oxidase negativa, orientará a identificação dos seguintes gêneros da família Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella ou Salmonella.

Uma TSI com pouco ou sulfureto de hidrogénio moderada no bisel alcalina com um fundo alcalina e uma oxidase positiva irá guiar o uso de ensaios para a identificação de não fermentar H ₂ S- produzir Gram-negativo varas, tais como Shewanella putrefaciens.

Por fim, o TSI pode ser utilizado para a investigação da produção de sulfeto de hidrogênio em bacilos Gram positivos, principalmente quando há suspeita de Erysipelothrix rhusiopathiae.

Semeado

O meio TSI deve ser inoculado com colônias puras, isoladas em culturas primárias ou seletivas. Se a colônia for retirada de meios seletivos semeados com amostras de flora mista, deve-se ter o cuidado de coletar apenas da superfície, uma vez que cepas viáveis ​​inibidas naquele meio podem existir na parte inferior da colônia.

Portanto, a alça nunca deve ser resfriada em meio seletivo e então a colônia é recolhida e inoculada com meio TSI.

A semeadura será feita com alça reta ou agulha. Será feita uma punção, prestando atenção para que passe pelo centro do meio até chegar ao fundo, para depois finalizar a semeadura inoculando a superfície em zigue-zague. Não faça dois furos.

Incubar a 37 ° C em aerobiose por 18-24 horas. Interprete neste momento, nem antes nem depois.

Limitações

O teste TSI deve ser lido dentro de 18 a 24 horas após a incubação. Uma leitura antes desse período pode dar um falso positivo para a fermentação A / A. Já uma leitura após esse tempo pode dar origem a uma imagem falsa negativa de um não fermentador, devido ao consumo de peptonas que alcalinizam o meio.

Referências

1. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial Panamericana. Bons ares. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
4. "Agar TSI." Wikipédia, a enciclopédia livre. 10 de julho de 2018, 08:09 UTC. 10 de fevereiro de 2019, 03:33 Disponível em: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. Agar TSI (Agar triplo de açúcar e ferro). 2015. Disponível em: britanialab.com
6. Laboratórios BD. Ágar ferro-açúcar triplo (Ágar TSI). 2003. Disponível em: bd.com