MANCHA DE WRIGHT: JUSTIFICATIVA, MATERIAIS, TÉCNICA E USOS - BIOLOGIA - 2025

A coloração de Wright é uma técnica de coloração criada pelo patologista americano James Homer Wright em 1902, com base na coloração de Romanowsky. Como a mancha de Romanowsky era instável, Wright incorporou metanol como solvente e fixador.

Essa coloração é policromática, o que significa que gera várias cores dependendo da estrutura que absorve o corante. Esta técnica de coloração tem sido amplamente utilizada para realizar contagens diferenciais de leucócitos e estudar a morfologia dos glóbulos vermelhos, plaquetas e leucócitos no sangue periférico e na medula óssea.

Vários esfregaços de sangue periférico manchados com a mancha de Wright. A. Leucemia aguda B. Plasmodium vivax no eritrócito. C. Plasmodium falciparum, macrogametócito. D. Linfócito

A sua aplicação é muito importante, uma vez que podem ser observadas anomalias nas diferentes linhas celulares do sangue, facilitando o diagnóstico de doenças como leucemia ou infecções bacterianas ou parasitárias.

Talvez essas sejam as aplicações mais comuns em que essa técnica é utilizada, porém não são as únicas. Também é útil em outras amostras além de sangue e medula óssea, como secreção nasal, muco fecal, expectoração, amostras de pele, entre outras.

Justificativa para a mancha de Wright

A mancha de Wright nasceu da mancha de Romanowsky, que consiste em uma solução de álcool metílico de um corante ácido (eosina Y) e um corante básico (azul de metileno) e seus produtos de oxidação.

A mistura de corantes usados ​​na coloração de Wright causa o efeito conhecido como Romanowsky, ou seja, dá uma bela coloração roxa aos núcleos dos leucócitos e grânulos neutrofílicos, enquanto as hemácias ficam rosadas.

Os componentes responsáveis ​​por dar a gama de cores típica da coloração de Wright são o azul B e a eosina Y. O efeito observado dependerá da ligação dos corantes às estruturas químicas e das interações do azul B e da eosina Y.

Estruturas ácidas, como ácidos nucléicos, proteínas nucleares e o citoplasma imaturo reativo de alguns tipos de células, fixam o azul B (coloração básica).

Enquanto estruturas básicas, como a hemoglobina, os grânulos de eosinófilos segmentados, entre outras estruturas celulares, ligam-se à eosina Y (corante ácido).

O resultado da coloração pode ser influenciado por diferentes fatores, como o pH do corante Wright, o tampão e a solução de lavagem; bem como o tempo de coloração e fixação.

Portanto, cada etapa da preparação dos reagentes é fundamental e deve ser realizada com atenção a cada detalhe.

materiais

Mancha de Wright. Para 100 mL é necessário:

Pesar 0,3 g do corante de Wright, medir 97 ml de metanol e 3 ml de glicerol.

Preparação

Coloque a grande quantidade de mancha de Wright em um almofariz e adicione gradualmente o glicerol até que o pó esteja completamente dissolvido.

Posteriormente, o metanol é adicionado, misturado e vertido em uma garrafa âmbar.

Antes de usar, a solução deve ser agitada com movimentos suaves e filtrada.

Solução tampão tamponada

Em um litro de água destilada, 3,76 g de hidrofosfato dissódico (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) mais 2,1 g de di-hidrogenofosfato de potássio (KH ₂ PO ₄) são adicionados.

Misture muito bem até que todos os reagentes incorporados estejam dissolvidos. Ajuste o pH para 7,2. Despeje em uma jarra de vidro e mantenha em temperatura ambiente.

Materiais adicionais necessários para realizar a coloração

Além disso, outros materiais são necessários para poder realizar a técnica de coloração, são eles: objetos de lâminas ou objetos de cobertura, ponte de coloração, camisetas com água ou tampão para lavagem, cronômetro para manter os tempos de coloração e algum material de secagem (papel absorvente, gaze ou algodão).

Componentes da mancha de Wright

Metanol

O álcool (metanol) serve como um fixador do esfregaço de sangue na lâmina.

É basicamente um reagente coagulante redutor, desidratante e fixador. Portanto, sua função é coagular proteínas e torná-las insolúveis, mas sem realmente desnaturá-las.

O metanol é o reagente de fixação de esfregaço mais utilizado em todos os laboratórios, pois apresenta melhores resultados que o etanol. A concentração ideal é de 99%.

Amortecedor

O tampão (solução tamponada) tem a função de ajustar ou manter o pH do corante, uma vez que um pH ajustado para 7,2 é essencial para que as estruturas celulares possam absorver os corantes adequadamente.

Por outro lado, a etapa de fixação do metanol desidrata as células e o tampão ajuda a reidratá-las.

Eosina (Y)

A eosina tem afinidade com os blocos de construção porque é um corante ácido. Dois tipos de eosina são conhecidos muito semelhantes entre si, tanto que qualquer um dos dois pode ser usado, obtendo-se o mesmo resultado.

Um é chamado de eosina Y, eosina amarela ou tetrabromofluoresceína, e o outro é chamado de eosina B, eritrosina B azulada ou dibromodinitrofluoresceína. No entanto, a eosina Y é a mais comumente usada.

A propriedade mais importante desse corante é sua polaridade negativa, o que o torna atraído por estruturas celulares carregadas positivamente.

Azul de metileno

É a coloração básica. Sua principal propriedade é a metacromasia, ou seja, nem todas as estruturas serão tingidas da mesma cor, isso depende da composição química das estruturas que estão sendo coloridas.

Alguns ficarão azul claro ou escuro, e alguns ficarão roxo escuro ou lilás claro.

Técnica

1-Realize o espalhamento da amostra de forma que fique uma película fina, seja sobre lâmina ou lamínula.

2-Deixe secar ao ar livre por aproximadamente 2 horas.

3-Coloque o esfregaço seco na ponte de coloração ou bandeja de coloração com a propagação da amostra voltada para cima.

4-Cubra a folha com a mancha de Wright gota a gota até que toda a superfície esteja coberta. Deixe por 5 a 8 minutos.

5-A mancha deve cobrir totalmente a lâmina, sem respingar nas bordas. Se durante o tempo de coloração começar a evaporar, adicione mais algumas gotas.

6-A seguir adicione igual quantidade do amortecedor, sopre um pouco até aparecer o brilho metálico característico. Tempo de 10 a 15 minutos.

7-Lave com água da torneira, passando o jato suave até que a folha fique rosa.

8-Com uma gaze embebida em álcool, retire o corante aderido no verso da lâmina.

9-Deixe o esfregaço secar muito bem antes de colocar o óleo de imersão para visualizá-lo ao microscópio.

Utilitário

Hematologia

É ideal para a coloração de esfregaços de sangue periférico, para o exame de esfregaços de sangue espesso e para o estudo de células de amostras de medula óssea.

Devido às propriedades químicas desta combinação de corantes, as estruturas celulares podem ser facilmente reconhecidas e os diferentes tipos de células presentes podem ser distinguidos.

Secreção nasal

Esta técnica é muito útil para identificar as células da secreção nasal (células epiteliais, eosinófilos segmentados, células polimorfonucleares) no diagnóstico da rinite alérgica.

parasitologia

Nesse sentido, tem sido útil para o estudo de Leishmania sp dentro dos histiócitos do tecido celular subcutâneo em úlceras cutâneas. Da mesma forma, é usado para identificar leucócitos em amostras de fezes (leucograma fecal).

Nesse caso, é do interesse do médico saber se a leucocitose presente nas fezes é polimorfonuclear ou mononuclear. Este achado no leucograma fecal guiará se é uma infecção bacteriana ou viral, respectivamente.

Por outro lado, os parasitas que circulam no sangue podem ser encontrados no eritrócito ou livres no plasma. Os parasitas procurados são Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii e filarias, e em medicina veterinária é útil na busca de Theileria equi e Babesia caballi, agentes causais da bebesiose, especialmente em cavalos.

A coloração de Wright e também a coloração de Giemsa permitem diferenciar hemoparasitas de componentes celulares normais. Dois tipos de spreads podem ser usados ​​para isso:

Espalhe fino

O sangue é espalhado como uma película fina em uma lâmina. É corado com a coloração de Wright, revelando as características do núcleo e do citoplasma.

Queda espessa

Essa metodologia é utilizada para investigar a presença de parasitas em uma quantidade maior de sangue.

Para fazer isso, uma grande gota de sangue é colocada em uma lâmina. Uma vez lá, deve ser desfibrilado, fazendo círculos cada vez maiores do centro para fora, usando a borda de outra lâmina.

Finalmente, para poder observar os parasitas no esfregaço espesso, os eritrócitos devem ser lisados ​​com água.

Infecções respiratórias

No nível respiratório, essa técnica também é útil, pois as células presentes nas amostras de escarro, lavado brônquico ou broncoalveolar são importantes para estabelecer o diagnóstico.

Da mesma forma, as células polimorfonucleares e as células mononucleares podem ser distinguidas aqui.

Bacteriologia

O uso desta técnica em bacteriologia é limitado porque não é boa para a coloração de bactérias, razão pela qual outras técnicas de coloração especializadas são utilizadas para sua coloração.

No entanto, tem sido usado para procurar células epiteliais com corpos de inclusão de Chlamydia trachomatis em esfregaços de mucosa uretral ou endocervical, embora deva ser reconhecido que não é o melhor método para isso.

Também é possível observar bactérias em espiral, como Borrelia burgdorferi, entre as hemácias em pacientes infectados, bem como mórulas ou corpos de inclusão de Ehrlichia sp no citoplasma de linfócitos, monócitos ou neutrófilos em um esfregaço de sangue.

Micologia

Histoplasma capsulatum é um fungo patogênico frequentemente diagnosticado por observação microscópica de várias amostras de tecido, coradas com a coloração de Wright.

Como são observadas as estruturas da amostra de sangue com a coloração de Wright?

Fonte: Retamales E, Mazo V. Instituto de Saúde Pública, Governo do Chile. Recomendações para a coloração de esfregaços de sangue para leitura do hemograma.

Recomendações para uma boa coloração

As lâminas de amostra de sangue devem secar ao ar espontaneamente. Os esfregaços devem ser os mais finos possíveis para obter uma melhor fixação do corante e evitar manchas excessivas.

Para uma coloração de alta qualidade, é aconselhável tingir dentro de duas horas após a preparação do esfregaço. Por outro lado, a amostra ideal é o sangue capilar, sem anticoagulante.

No entanto, se for utilizado sangue venoso, deve ser utilizado como anticoagulante EDTA e não heparina, pois esta pode deformar estruturas celulares.

Para evitar a deterioração do corante preparado, ele deve ser armazenado em locais secos.

Durante o processo de lavagem recomenda-se o uso de água com pH neutro.

Finalmente, é aconselhável testar os métodos de coloração usados ​​no laboratório de vez em quando.

Isso é feito pela coloração de amostras ou padrões estendidos, como um controle de qualidade. Esta etapa é importante, pois garante que a coloração seja adequadamente preparada e os tempos de coloração sejam bem padronizados.

Se a folha de padrão estiver mal colorida, há problemas que devem ser resolvidos.

Erros comuns na coloração de Wright

Mancha muito pálida

Esfregaços muito claros geralmente são causados ​​por um tempo de coloração muito curto ou lavagem excessiva. É corrigido alongando o tempo de contato com o corante ou diminuindo o tempo de lavagem.

Precipitados de corante

A presença de precipitados de corante no esfregaço pode ter várias causas, porém, as causas mais frequentes são: uso de corante não filtrado, manchamento em pontes de manchamento desiguais, uso de lençóis sujos de poeira ou graxa, não lavar bem coloração completa.

Mancha extremamente vermelha ou azul

O tampão é responsável pelo pH do corante. Corantes com pH abaixo do indicado (ácidos) resultarão em manchas muito avermelhadas.

Se o pH do corante estiver acima (alcalino), uma mancha extremamente azulada será obtida.

Modo de armazenamento

O reagente deve ser armazenado em temperatura ambiente.

Referências

1. Gutiérrez V. Estudo comparativo entre o método de coloração de Wright e o teste Elisa para o diagnóstico de erliquiose canina na cidade de San Pedro Sula, Honduras. 2008. Tese de Graduação para qualificação para o Grau de Medicina Veterinária. Universidade de San Carlos da Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Corantes básicos no laboratório de microbiologia. Pesquisa em deficiência. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Mancha de Wright." Wikipédia, a enciclopédia livre. 18 de maio de 2018, 12h05 UTC. 8 de dezembro de 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Freqüência de Babesia spp. na caça de cavalos, Córdoba (Colômbia). Rev. divulg cient udcaactual. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Instituto de Saúde Pública Governo do Chile. Recomendações para a coloração de esfregaços de sangue para leitura do hemograma.