COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN: JUSTIFICATIVA, REAGENTES E TÉCNICA - BIOLOGIA - 2025

O Ziehl-Neelsen é uma técnica de coloração para identificar microorganismos resistentes ao álcool ácido (ARA). O nome desse procedimento de microbiologia refere-se a seus autores: o bacteriologista Franz Ziehl e o patologista Friedrich Neelsen.

Esta técnica é um tipo de coloração diferencial, que implica a utilização de diferentes tinturas de forma a criar contraste entre as estruturas que se pretende observar, diferenciar e posteriormente identificar. A coloração Ziehl-Neelsen é usada para identificar certos tipos de microorganismos.

Coloração Ziehl-Neelsen

Alguns desses organismos são micobactérias (por exemplo, Mycobacterium tuberculosis), nocardia (por exemplo, Nocardia sp.) E alguns parasitas unicelulares (por exemplo, Cryptosporidium parvum). Muitas das bactérias podem ser classificadas por meio de uma técnica comum chamada coloração de Gram.

No entanto, alguns grupos bacterianos requerem outros métodos para serem capazes de identificá-los. Técnicas como a coloração de Ziehl-Neelsen requerem combinações de corantes com calor para fixar o primeiro à parede celular.

Em seguida, vem um processo de branqueamento que permite dois resultados: resistência ou sensibilidade à descoloração por ácidos e álcoois.

Base

A justificativa para essa técnica de coloração é baseada nas propriedades da parede celular desses microrganismos. A parede é composta por um tipo de ácidos graxos chamados ácidos micólicos; Estes são caracterizados por terem cadeias muito longas.

Quando os ácidos graxos têm estruturas muito longas, eles podem reter os corantes com mais facilidade. Alguns gêneros bacterianos são muito difíceis de corar pela coloração de Gram, devido ao alto conteúdo de ácidos micólicos na parede celular.

A coloração Ziehl-Neelsen usa o composto fenólico carbol fucsina, uma coloração básica. Ele tem a capacidade de interagir com os ácidos graxos da parede celular, cuja textura é de cera em temperatura ambiente.

A coloração com carbol-fucsina é aumentada na presença de calor, porque a cera derrete e as moléculas do corante se movem mais rapidamente para a parede celular.

O ácido que é usado posteriormente serve para descolorir células que não foram coradas porque sua parede não estava suficientemente relacionada com o corante; portanto, a força do alvejante ácido é capaz de remover o corante ácido. As células que resistem a essa descoloração são chamadas de ácido-resistentes.

Corante secundário

Após a descoloração da amostra, ela é contrastada com outro corante denominado corante secundário. Geralmente, é usado azul de metileno ou verde malaquita.

O corante secundário mancha o material de fundo e, conseqüentemente, cria contraste com as estruturas que foram manchadas na primeira etapa. Apenas as células descoloridas absorvem o segundo corante (contracoloração) e assumem sua cor, enquanto as células ácido-resistentes retêm sua cor vermelha.

Esse procedimento é frequentemente utilizado para a identificação do Mycobacterium tuberculosis e do Mycobacterium leprae, denominados bacilos álcool-ácido resistentes.

Reagentes

Corante primário

É usado carbol fucsina a 0,3% (filtrado). Este corante é preparado a partir de uma mistura de álcoois: fenol em etanol (90%) ou metanol (95%), e nesta mistura são dissolvidos 3 gramas de fucsina básica.

Solução de branqueamento

Nesta etapa, podem ser utilizadas soluções de ácido alcoólico a 3% ou ácido sulfúrico a 25%.

Corante secundário (contra-corante)

O corante mais usado para contrastar as amostras é geralmente o azul de metileno 0,3%. No entanto, outros também podem ser usados, como 0,5% de verde malaquita.

Técnica

Procedimento de coloração ácido-resistente

Prepare um esfregaço bacteriano

Este preparo é feito em lâmina limpa e seca, seguindo as precauções de esterilidade.

Esfregaço

Deixe o esfregaço secar em temperatura ambiente.

Aqueça a amostra

A amostra deve ser aquecida com fogo na lâmina abaixo. A fixação do álcool pode ser feita quando o esfregaço não foi preparado com escarro (tratado com hipoclorito de sódio para clarear) e se não manchar imediatamente.

O M. tuberculosis é removido com lixívia e durante o processo de coloração. A fixação por calor de expectoração não tratada não mata M. tuberculosis, enquanto a fixação de álcool é bactericida.

Cubra a mancha

A mancha é coberta com a solução de carbol-fucsina (mancha básica primária).

Aqueça a mancha

Isso é feito por 5 minutos. Você deve notar uma evolução do vapor (aproximadamente 60 ° C). É importante não superaquecer e evitar queimar a amostra.

No que diz respeito ao aquecimento da mancha, deve-se tomar muito cuidado ao aquecer o carbol-fucsina, especialmente se a coloração for realizada em uma bandeja ou outro recipiente no qual tenham sido coletados produtos químicos altamente inflamáveis ​​da coloração anterior.

Apenas uma pequena chama deve ser aplicada sob as lâminas usando um cotonete previamente aceso umedecido com algumas gotas de álcool ácido, metanol ou etanol 70%. Evite usar um cotonete embebido em etanol, pois há risco de incêndio.

Lave a mancha

Esta lavagem deve ser feita com água limpa. Se a água da torneira não estiver limpa, lave o esfregaço com água filtrada ou destilada, de preferência.

Cubra o esfregaço com álcool ácido

Este álcool ácido deve ser de 3%. A cobertura é realizada durante 5 minutos ou até o esfregaço ficar suficientemente descolorido, ou seja, de cor rosa pálido.

Deve-se levar em consideração que o álcool ácido é inflamável; portanto, deve ser usado com muito cuidado. Evite estar perto de fontes de ignição.

Lave a mancha

A lavagem deve ser feita com água destilada limpa.

Cubra o esfregaço com mancha

Pode ser cor de verde malaquita (0,5%) ou azul de metileno (0,3%) por 1 a 2 minutos, usando o tempo mais longo se o esfregaço for fino.

Lave a mancha

Novamente, água limpa (destilada) deve ser usada.

Drenar

O verso da lâmina deve ser limpo e a mancha colocada em um escorredor para permitir que seque ao ar (não use papel absorvente para secar).

Examine o esfregaço ao microscópio

A objetiva 100X e o óleo de imersão devem ser usados. Escaneie o esfregaço sistematicamente e registre as observações pertinentes.

Interprete os resultados

Teoricamente, os microrganismos que mancham uma cor avermelhada são considerados ácido-resistentes positivos (AAR +).

Pelo contrário, se os microrganismos se tingirem de azul ou verde, dependendo do corante usado como contra-corante, são considerados ácidos resistentes negativos (AAR-).

Referências

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1ª ed.). Jaypee Brothers Medical Publishers.
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3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Introductory Microbiology (1ª ed.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. e Morton, V. (2006). Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: Applications to Patient Care (11ª ed.). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Textbook of Microbiology (1ª ed.). Publicações de BI PVT.