- Base
- Técnica
- materiais
- Preparação de carbol fucsina Kinyoun
- Preparação do ácido-álcool
- Preparação do corante de contraste azul de metileno
- Técnica de coloração Kinyoun
- Técnica especial de Kinyoun para Nocardias
- Técnica combinada de carbol fucsina e tricrômico modificada por Didier
- Controle de qualidade
- Técnica de Kinyoun em comparação com a técnica de Ziehl-Neelsen
- Referência
A coloração Kinyoun é uma técnica de coloração usada para manchar bactérias e álcool ácido resistente a parasitas. Nasceu da modificação da coloração Ziehl-Neelsen; Ambas as técnicas são interpretadas da mesma forma, mas diferem em dois elementos: na preparação do reagente principal e na técnica de Kinyoun não utilizar calor.
Por esta razão, também é conhecida como mancha fria de Ziehl-Neelsen ou Kinyoun modificada a frio. É indicado para a coloração de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, micobactérias atípicas, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris e Cyclosporas cayetanensis.
Cryptosporidium parvum corado com coloração de Kinyoun. Punlop Anusonpornperm, do Wikimedia Commons
É importante ressaltar que Nocardia tingem fracamente com esta técnica por serem parcialmente resistentes ao álcool ácido, portanto para este gênero há uma modificação na metodologia.
Por sua vez, a técnica de Kinyoun frio foi combinada com a técnica de tricromo modificada por Didier para a detecção de coccídios (Cryptosporidium parvum e Isospora belli) e esporos de microsporidium (Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon intestinalis).
Base
O principal reagente de coloração é a carbolfucsina ou carbolfucsina, que tem a propriedade de se ligar aos ácidos carbólicos dentro da parede celular cerosa rica em lipídios (ácidos micólicos) de micobactérias e certos parasitas.
Essa ligação não é neutralizada pelo alvejante ácido; portanto, os microrganismos são definidos como álcool-ácido resistentes.
Ao contrário da técnica de Ziehl-Neelsen -que fixa o corante por meio do calor-, na técnica de Kinyoun esta etapa não é necessária, pois a solução de fucsina carbólica preparada para esta técnica contém uma alta concentração de fenol.
O fenol dissolve o material lipídico da parede celular, permitindo a entrada do corante carbolfuchsin. Depois que o corante penetra, ele permanece fixo apesar da lavagem com álcool ácido.
Desta forma, os microrganismos álcool-ácido resistentes assumem a cor característica vermelha, enquanto tudo o que não é ácido-resistente fica descolorido e manchado de azul.
Técnica
materiais
- Fucsina carbol modificada.
- Álcool-ácido.
- Azul de metileno.
Preparação de carbol fucsina Kinyoun
- Fucsina básica: 4 gr.
- Fenol: 8 ml.
- Álcool (95%): 20 ml.
- Água destilada: 100 ml.
A fucsina básica deve ser dissolvida lentamente no álcool, misturando constantemente. Posteriormente, o fenol cristalizado é derretido em banho-maria a 56 ° C. Uma vez dissolvido, 8 ml são adicionados à solução de fucsina preparada acima.
Preparação do ácido-álcool
- Ácido clorídrico concentrado: 3 ml.
- Etanol (95%): 97 ml.
Deve ser medido, unido e misturado.
Preparação do corante de contraste azul de metileno
- Azul de metileno: 0,3 g.
- Água destilada: 100 ml.
É pesado e dissolvido.
Técnica de coloração Kinyoun
1- Preparar um esfregaço diretamente da amostra, que pode ser escarro, líquido pulmonar, sedimento urinário, líquido cefalorraquidiano ou fezes, entre outros; ou de uma suspensão de microrganismos obtidos de colônias puras desenvolvidas em meios de cultura primários.
2- Fixe o esfregaço com calor.
3- Coloque o esfregaço na ponte de coloração e cubra com o reagente Kinyoun carbol fucsina preparado. Deixe descansar por 3 a 5 minutos.
4- Lave com água destilada.
5- Lixívia com álcool ácido por 3 minutos e lave novamente com água destilada.
6- Lixívia novamente com álcool ácido por 1 ou 2 minutos até que não haja mais coloração.
7- Lave com água destilada e deixe escorrer, colocando a lâmina na posição vertical.
8- Cubra o preparado com azul de metileno e deixe agir por 4 minutos.
9- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.
10- Examine a 40X e depois a 100X.
Para melhorar e acelerar a coloração de microrganismos álcool-ácido resistentes, adicione 1 gota de um agente umectante (como o Tergitol nº 7) a 30 a 40 ml de Kinyoun Carbol Fuchsin.
Alguns laboratórios mudam o corante de contraste azul de metileno para verde brilhante ou ácido pícrico; o primeiro dá uma cor verde ao fundo e o segundo gera uma cor amarela.
Técnica especial de Kinyoun para Nocardias
Para melhorar a coloração de bactérias do gênero Nocardia, uma modificação da coloração Kinyoun é usada. A técnica é a seguinte:
1- Cubra o esfregaço com carbol-fucsina Kinyoun por 3 minutos.
2- Lave com água destilada.
3- Descolorir brevemente com álcool ácido preparado a 3% até que não haja mais coloração.
4- Lave novamente com água destilada.
5- Cubra o preparado com azul de metileno e deixe agir por 30 segundos.
6- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.
Técnica combinada de carbol fucsina e tricrômico modificada por Didier
Essa técnica é recomendada para a análise de amostras de fezes para coccídios e esporos de Microsporidium ao mesmo tempo. O procedimento a seguir é o seguinte:
1- Cubra o esfregaço com carbol-fucsina Kinyoun por 10 minutos.
2- Retire o corante e lave com água destilada.
3- Lixívia por 30 segundos com álcool ácido clorídrico.
4- Lave novamente com água destilada.
5- Cubra o esfregaço com solução tricrômica por 30 minutos a 37 ° C.
6- Lave com água destilada.
7- Lixívia por 10 segundos com álcool ácido acético.
8- Lave o esfregaço por 30 segundos com etanol 95%.
Controle de qualidade
Como controle positivo, esfregaços com cepas de Mycobacterium tuberculosis são preparados e corados com os reagentes preparados para verificar se as bactérias adquirem a cor apropriada (vermelho-fúcsia).
Os controles negativos também podem ser usados preparando esfregaços com qualquer cepa que não seja álcool ácido rápido, verificando assim se toda a amostra adquire a cor contrastante.
Técnica de Kinyoun em comparação com a técnica de Ziehl-Neelsen
A técnica de Kinyoun é mais simples, pois elimina a etapa de aquecimento, mas sua principal vantagem é evitar a emissão de vapores, altamente tóxicos e cancerígenos em longo prazo. Portanto, a coloração Kinyoun é mais segura para o pessoal de coloração.
É importante levar em consideração que se deve ter cuidado para que os reagentes não entrem em contato direto com a pele, pois são corrosivos e o alvejante é inflamável.
Quanto às desvantagens, um esfregaço negativo não indica necessariamente que o organismo não está presente. Além disso, a presença de detritos celulares pode levar a falsos positivos, levando a confusão no diagnóstico.
Referência
- Química Clínica Aplicada. (2016). BK Kinyoun Kit. Disponível em: cromakit.es
- Orozco-Rico Miguel. Coloração de Kinyoun e dois coccídios no HIV. Medical Journal MD. 2011; 3 (2): 137
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
- Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
- Colaboradores da Wikipedia. "Mancha de Kinyoun." Wikipédia, a enciclopédia livre. Wikipedia, The Free Encyclopedia, 8 de fevereiro de 2018. Web. 5 de janeiro de 2019.
- Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Implementação de uma técnica de coloração para o diagnóstico simultâneo de Coccidia e Microsporidia. Instituto de Higiene da Universidade da República. Montevidéu. Uruguai. Disponível em: Hygiene.edu.uy