TESTE DE CATALASE: JUSTIFICATIVA, TÉCNICA E USOS - BIOLOGIA - 2025

O teste da catalase é uma metodologia usada em laboratórios de bacteriologia para revelar a presença da enzima catalase nas bactérias que a possuem. Juntamente com a coloração de Gram, são os principais testes que devem ser realizados em microrganismos recém-isolados. Esses testes orientam o microbiologista sobre os passos a seguir para a identificação definitiva do microrganismo em questão.

Em geral, as bactérias que contêm citocromo possuem a enzima catalase, o que significa que as bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas devem possuí-la. Porém, há exceções, como o Streptococcus, que apesar de ser microorganismo anaeróbio facultativo, não possui a enzima catalase.

Executando o Teste de Catalase, mostrando uma reação positiva. Fonte: Nenhum autor legível por máquina fornecido. Nase assumiu (com base em reivindicações de direitos autorais).

É por isso que o teste da catalase é usado principalmente para distinguir as famílias Staphylococaceae e Micrococaceae (ambas catalase positiva) da família Streptococaceae (catalase negativa).

Da mesma forma, o gênero Bacillus (catalase positiva) é diferenciado do gênero Clostridium (catalase negativa), entre outros.

Base

A catalase é uma enzima classificada como hidroperoxidase, ou seja, utilizam o peróxido de hidrogênio (H ₂ O ₂) como substrato.

Também é considerada uma oxidorredutase, pois na reação em que participa há um elemento que atua como doador de elétrons (substância redutora) e outro como receptor de elétrons (substância oxidante).

A catalase é uma proteína que contém um grupo prosérico com quatro átomos de ferro trivalentes (Fe ⁺⁺⁺), portanto é uma homoproteína. O íon férrico permanece oxidado durante a reação.

Pode-se dizer que a catalase é uma enzima desintoxicante, pois sua função é eliminar substâncias que são produzidas durante o metabolismo bacteriano e que são tóxicas para as bactérias. Entre essas substâncias está o peróxido de hidrogênio.

O peróxido de hidrogênio é formado a partir da quebra de açúcares aerobicamente. Este processo ocorre da seguinte forma:

O íon superóxido (O ₂ ^-) (radical livre) é formado como produto final da assimilação da glicose pela via aeróbia. Este é tóxico e é eliminado pela enzima superóxido dismutase, que o transforma em oxigênio gasoso e peróxido de hidrogênio.

O peróxido de hidrogênio também é tóxico para as bactérias e deve ser removido. A enzima catalase decompõe o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.

A catalase pode atuar em outros substratos além do peróxido de hidrogênio, como álcoois, aldeídos, ácidos, aminas aromáticas e fenóis. No entanto, o peróxido de hidrogênio também pode ser usado pela catalase para oxidar outros compostos tóxicos, como o álcool metílico e etílico.

Da mesma forma, a catalase está presente nas células fagocíticas, protegendo-as da ação tóxica do peróxido de hidrogênio.

Técnica de rotina para teste de catalase

- Método deslizante

materiais

3% de peróxido de hidrogênio (10 volumes).

Lâmina de microscópio

Cabo de plástico descartável ou palito de madeira.

Processo

Pegue o suficiente da colônia para estudar sem tocar no ágar de onde veio. A colônia deve ser fresca, ou seja, de uma cultura de 18 a 24 horas.

Coloque a colônia na lâmina seca e adicione uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% (30% de H ₂ O ₂ também pode ser usado). Observe imediatamente se as bolhas são liberadas ou não.

Interpretação

Reação positiva: evolução de gás, evidenciada pela formação de bolhas (forte borbulhamento).

Reação negativa: sem formação de bolhas.

- Método direto em cultura pura

Coloque 1 ml de H ₂ O ₂ a 3% em uma placa pura ou cultura em cunha que não contenha sangue (de preferência ágar nutriente). Observe se há ou não formação de bolhas imediatamente. 30% de H ₂ O ₂ também pode ser usado.

É interpretado da mesma forma que o método porta object.

-Método com tubo capilar ou Fung e Petrishko

Preencher um tubo capilar de 67 mm até uma altura de 20 mm com peróxido de hidrogênio 3% por capilaridade.

Toque a colônia isolada a ser estudada com o capilar preenchido com 3% de H ₂ O ₂ . Observe se o capilar se enche de bolhas em aproximadamente 10 segundos. Este método permite a semiquantificação da reação em cruzamentos:

Sem cruzes não há bolhas (reação negativa).

+ ---- Poucas bolhas (reação fraca ou retardada).

++ --– Bolhas abundantes (reação moderada).

+++ --As bolhas alcançam o lado oposto (reação forte).

-Método Taylor e Achanzar para testes de catalase que dão questionável

Coloque uma colônia isolada em uma lâmina limpa e seca, coloque uma gota de 0,5% de H ₂ O ₂ e cubra com uma lamela. Observe se há formação de bolhas presas ou não.

Interpretação: a presença de bolhas indica uma reação positiva. Sem bolhas, é interpretado como uma reação negativa.

Teste de catalase para espécies de Mycobacterium

Essa técnica precisa ser feita controlando o pH e a temperatura. Deve ser realizado sob uma capela de fluxo laminar, uma vez que a manipulação das diferentes espécies de Mycobacterium é perigosa.

-Materiais

Peróxido de hidrogênio 30% ou 110 volumes (superoxal).

Tampão de fosfato pH 7

10% Tween 80

Cultura de Mycobacterium wedge por 3 a 4 semanas

-Preparação

Tampão de fosfato pH 7

Pesar:

1,361 g de fosfato monopotássico anidro (KH ₂ PO ₄).

1,420 g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO3).

Dissolver os dois sais em um pouco de água destilada estéril e perfazer a 1000 ml com água.

10% Tween 80

Faça uma diluição de 1:10 para o Tween 80 que está comercialmente concentrado, para fazer isso, proceda da seguinte forma:

Pegar 1 ml de Tween 80 e colocar em um pouco de água destilada, dissolver e perfazer o volume com água até 10 ml.

Reagente final

Misture uma quantidade de tampão de fosfato com uma quantidade de Tween 80 a 10% (partes iguais). Defina em laboratório o quanto deseja preparar.

-Processo

Coloque 5 ml de tampão fosfato em um tubo de ensaio estéril com tampa de rosca (baquelite).

Com uma alça de inoculação, pegue colônia suficiente de um crescimento de Mycobacterium semeado em fatias e dissolva no tampão de fosfato.

Tampe o tubo sem apertar demais a rosca. Coloque em banho-maria a 68 ° C por 20 a 30 minutos. Retire e deixe esfriar a 22-25 ° C

Meça 0,5 ml do reagente final (mistura) e adicione-o ao tubo com a solução fria. Observe a formação ou não de bolhas.

É interpretado da mesma forma que as técnicas anteriores.

Usar

Quando o crescimento da colônia é obtido em meio enriquecido, uma coloração de Gram e um teste de catalase devem ser realizados nas colônias obtidas. Isso orientará o microbiologista sobre os procedimentos a seguir para a identificação definitiva.

Fonte: Elaborado pelo autor MSc. Marielsa gil

Controle de qualidade

Para avaliar o bom desempenho do reagente de peróxido de hidrogênio, use cepas de controle recém-cultivadas, como Staphylococcus aureus como controle positivo e cepas de Streptococcus sp como controle negativo.

Outra alternativa que serve como controle positivo é colocar uma gota de peróxido de hidrogênio no ágar sangue, os eritrócitos possuem catalase, portanto, haverá borbulhamento se o reagente estiver em boas condições.

Um ágar chocolate pode ser usado como controle negativo, aqui os eritrócitos já estão lisados ​​e o teste é negativo.

Limitações

-Não use culturas antigas para o teste, pois isso pode causar falsos negativos.

- Evite colher colônias de culturas em ágar sangue, se tiver cuidado para não tocar no ágar; Esse procedimento pode levar a falsos positivos, pois os glóbulos vermelhos contêm catalase.

-Se tirar a colônia com cabo de platina, não inverta a ordem do procedimento, pois isso pode gerar falsos positivos. Isso ocorre porque a platina é capaz de reagir com o peróxido de hidrogênio, causando um borbulhamento.

-Não use o reagente de peróxido de hidrogênio se for muito antigo, pois o reagente é muito instável e tende a quebrar com o tempo.

-Mantenha o reagente de peróxido de hidrogênio protegido da luz e refrigerado para evitar danos.

- Efetue um controle de qualidade do reagente de peróxido de hidrogênio cada vez que for usado.

-Leve em consideração que se 30% de H ₂ O ₂ for usado, as reações são mais fortes do que aquelas realizadas com 3% de H ₂ O ₂.

Referências

1. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial Panamericana. Bons ares. Argentina.
4. Laboratórios BD. Reagente Catalase-Gotario. Disponível em:
5. Laboratórios Vadequímica. Água oxigenada. Equivalência entre volumes e porcentagem. Disponível em: vadequimica.com