- Base
- Técnicas par
- -Anthony mancha
- materiais
- Processo
- Interpretação
- Vantagem
- Desvantagens
- - Coloração negativa
- materiais
- Processo
- Vantagem
- Desvantagens
- Interpretação
- - Técnica de tinta indiana
- materiais
- Processo
- Interpretação
- Referências
A cápsula de coloração é uma técnica de coloração diferencial que tem a propriedade de estressar a estrutura do polissacarídeo envolvendo certas bactérias e leveduras, denominada cápsula. É usado em laboratórios clínicos para ajudar no diagnóstico de certas patologias causadas por microrganismos encapsulados.
É também utilizado em laboratórios de ensino para demonstração dessa estrutura morfológica a estudantes de carreiras das ciências da saúde, tais como: medicina, bioanálise, enfermagem ou citotecnologia, entre outras.
Esfregaço de Klebsiella pneumoniae corado com coloração de cápsula. Método de tinta nanquim com safranina. Fonte: А.А.В
Existem várias técnicas simples para demonstrar a presença da cápsula nos microrganismos que a possuem, são elas: a coloração negativa, a coloração de Anthony e uma variante que combina as duas anteriores.
A coloração negativa é usada principalmente em amostras de LCR quando há suspeita da presença da levedura Cryptococcus neoformans. Esta levedura é uma causa comum de meningite.
Esta técnica utiliza nigrosina ou tinta nanquim e baseia-se na criação de um contraste entre o fundo da preparação e a cápsula impenetrável do microrganismo. O fundo fica escuro e a cápsula fica incolor. Desta forma, essa estrutura é revelada.
Em relação à técnica Anthony, pode-se dizer que ela é mais utilizada em laboratórios de ensino para demonstrar a estrutura polissacarídica em bactérias como Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis.
A utilização dessa técnica para fins diagnósticos é muito rara, visto que existem outros exames de rotina que permitem a identificação desses microrganismos.
Base
A cápsula é uma estrutura forte de natureza polissacarídica. Isso protege os microrganismos da fagocitose e, portanto, é uma estrutura de difícil penetração.
É por isso que as manchas em cápsula são baseadas no contraste. Os corantes mancham o fundo da preparação enquanto a cápsula permanece incolor.
Portanto, com essas técnicas, a cápsula é facilmente reconhecível. Se o microrganismo não tiver cápsula, não será distinguível com este tipo de coloração, pois tudo ficará manchado da mesma cor.
Todas as técnicas utilizadas para colorir a cápsula têm o mesmo raciocínio, apesar de usarem corantes e procedimentos diferentes.
Técnicas par
-Anthony mancha
A mancha de Anthony usa violeta cristal como uma mancha. Isso manchará o corpo bacteriano e o fundo de roxo.
Por outro lado, 20% de sulfato de cobre é usado. Este serve como solução de lavagem, ou seja, remove o excesso de cristal violeta do preparo, tornando as cápsulas límpidas, mas sem que o corpo bacteriano ou o fundo percam a cor.
materiais
- Leite iridescente.
- Deslizar.
- 1% de cristal violeta.
- 20% de sulfato de cobre.
- Microscópio óptico.
- Óleo de imersão.
Processo
Esta técnica consiste em:
- Cultive o microrganismo em leite iridescente por 36 horas.
- Coloque uma gota da cultura no final de uma lâmina e próximo a ela coloque uma gota de vidro violeta, misture e espalhe com a extremidade de outra lâmina.
- Seque ao ar livre e não coloque no calor.
- Lavar com solução de sulfato de cobre a 20% e deixar secar ao ar.
- Observe ao microscópio com objetiva de imersão. Pesquise nas extremidades da propagação.
É importante não usar calor nem para fixar nem secar, pois isso danifica a cápsula. Também não lave com água.
Interpretação
O leite iridescente é um excelente meio de cultura, pois fornece os nutrientes necessários para que o microrganismo desenvolva uma cápsula proeminente.
Por outro lado, o leite iridescente formará um fundo grosso e compacto que ficará manchado de roxo junto com o corpo bacteriano, mas a cápsula que envolve o microrganismo permanecerá incolor. Portanto, um halo claro é observado ao redor do corpo bacteriano.
Representação gráfica na observação microscópica de um esfregaço de Klebsiella pneumoniae corado com a coloração de Anthony. Fonte: Elaborado pelo autor MSc. Marielsa Gil.
Vantagem
É uma técnica simples de executar. Não requer conserto.
Além disso, deve-se notar que outros meios de cultura podem ser usados, mas o meio de leite é o preferido porque tem a vantagem de fornecer cápsulas mais proeminentes.
Desvantagens
É uma técnica um pouco mais trabalhosa do que a coloração negativa e sua visualização requer esperar que a preparação seque completamente.
- Coloração negativa
materiais
- Slides de slides.
- Meio de cultura com o microrganismo.
- Tinta da China ou nigrosina.
- Microscópio óptico.
- Solução salina fisiológica.
Processo
Coloque uma gota de soro fisiológico na lamela e dissolva uma pequena porção da cultura microbiana. É importante que a preparação não seja muito espessa. Em seguida, coloque uma gota de tinta da China ou nigrosina e misture.
Uma folha de lamínula é então colocada sobre a preparação sem transbordar o líquido. Ele é observado ao microscópio, primeiro focando em uma objetiva de 10X e depois movendo para 40X.
Esta técnica também pode ser usada diretamente em amostras de CSF. Ou seja, em vez de colocar uma gota de cultura microbiana, é colocada uma gota de LCR.
Vantagem
É um método simples de executar e ao mesmo tempo barato. Não requer fixação ou secagem do preparado.
Desvantagens
A desvantagem é que deve ser observado ao microscópio antes que o preparo seque, pois se isso acontecer os microrganismos se contraem, dificultando a visualização.
Por outro lado, podem ocorrer falsos positivos se o analista for inexperiente, uma vez que leucócitos costumam ser confundidos com leveduras.
A observação de cápsulas de levedura com a técnica da tinta da China ou nigrosina deve ser considerada como diagnóstico presuntivo de Cryptococcus neoformans até que seja demonstrado com cultura.
Isso porque existem outras leveduras que podem ser causadoras de meningite e não apenas Cryptococcus neoformans, como as do gênero Candida e Rhodotorula, além de outras espécies de Cryptococcus.
Interpretação
Se houver microrganismos encapsulados, será observado um fundo escuro, com corpos transparentes flutuando no líquido, destacando a presença da cápsula.
Cápsula de Cryptococcus neoformans manchada com tinta chinesa. Fonte: Crédito da foto: Provedores (es) de conteúdo: CDC / Dr. Leanor haley
- Técnica de tinta indiana
Essa técnica também pode ser feita com nigrosina. É uma combinação das técnicas explicadas anteriormente. Esta técnica usa violeta cristal e tinta da Índia ou nigrosina.
O corpo bacteriano assume a cor roxa do cristal violeta porque tem carga negativa, enquanto a nigrosina colore a parte inferior do esfregaço. Se a bactéria tiver uma cápsula, ela aparecerá como um halo transparente ao redor do microorganismo.
O violeta cristal pode ser substituído por qualquer uma destas cores: safranina, fucsina básica ou azul de metileno.
materiais
- Vidro violeta.
- Nigrosina ou tinta nanquim.
- Slides de slides.
- Microscópio.
Processo
- Cultive o microrganismo em meio de cultura.
- Coloque uma gota da cultura no final de uma lâmina e próximo a ela coloque uma gota de nanquim cristalino ou nigrosina, misture e espalhe com a ponta de outra lâmina.
- Seque ao ar livre e não fixe ao calor.
- Cubra com uma solução de cristal violeta por 1 minuto, lave com água destilada mas muito delicadamente (jato suave), deixe secar ao ar livre.
- Observe ao microscópio com objetiva de imersão. Pesquise nas extremidades da propagação.
Interpretação
Um corpo bacteriano roxo e um fundo escuro serão vistos. A cápsula, se presente, parecerá incolor ao redor da bactéria.
Referências
- Covadonga A, Silóniz M, Serrano S. Técnicas básicas de Microbiologia. Observação de bactérias. Reduca (Biologia). Microbiology Series. 2010; 3 (5): 15-38. D
- López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Corantes básicos no laboratório de microbiologia. Mediagraphic.org. 2014; 3 (1): 10-18. Disponível em: medigraphic.com
- Gil M. Coloração negativa: justificativa, técnica, vantagens e desvantagens. Lifeder.com.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
- Tankeshwar A. Capsule Stain: Princípio, Procedimento e Resultados. 2019. Guia de Microbiologia Médica. Disponível em: microbeonline.com