COLORAÇÃO DE GRAM: JUSTIFICATIVA, MATERIAIS, TÉCNICA E USOS - BIOLOGIA - 2024

A coloração de Gram é a técnica de coloração mais simples e útil em microbiologia diagnóstica. Essa técnica foi criada pelo médico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884, que conseguiu classificar as bactérias em Gram positivas e Gram negativas, de acordo com a composição da parede celular.

A técnica passou por certas modificações por Hucker em 1921 para estabilizar os reagentes e melhorar a qualidade da coloração, razão pela qual a coloração de Gram também é conhecida como Gram-Hucker.

Vários esfregaços corados com coloração de Gram. A. Cocos Gram positivos. B. Bastonetes Gram negativos. C. Bacilos Gram-positivos, polimorfonucleares e mononucleares. D. Leveduras.

Com essa técnica também é possível observar a forma dos microrganismos, ou seja, se são cocos, bacilos, cocobacilos, pleomórficos, filamentosos, entre outros. Bem como a sua distribuição no espaço: em aglomerado, em cadeia, isolado, em pares, em tétrades, etc.

Quando há suspeita de infecção bacteriana, a maioria das amostras recebidas deve ser esfregada em uma lâmina e corada de Gram para exame microscópico.

O laudo do Gram orientará o médico sobre qual tipo de microrganismo pode ser a causa da infecção, antes da obtenção do resultado final da cultura.

Em alguns casos a vida do paciente fica muito comprometida, pois os médicos precisam urgentemente do laudo de Gram para fazer um tratamento empírico, enquanto aguardam a identificação do microrganismo.

Por exemplo, se o Gram revelar que há cocos Gram positivos no líquido cefalorraquidiano, o médico orientará a terapia inicial com antibióticos que eliminem esse tipo de bactéria, de acordo com os protocolos estabelecidos para isso.

Assim que chegar o resultado final com o nome do microrganismo isolado e seu respectivo antibiograma, o médico avaliará se deve ou não mudar a terapia. Essa decisão será tomada de acordo com o estudo de susceptibilidade do microrganismo aos antibióticos que está recebendo e a evolução do paciente.

Base

Esta é uma técnica que possui 4 etapas fundamentais: coloração, fixação com o mordente, descoloração e contracoloração. Portanto, essa técnica, além de colorir as bactérias, também permite que elas sejam diferenciadas.

O violeta cristal é o primeiro corante usado. Tem afinidade pelo peptidoglicano e vai corar de púrpura todas as bactérias presentes, então é colocado o lugol, que atua como mordente, ou seja, vai induzir a formação de complexos de cristal violeta-iodo insolúveis - proteínas ribonucleares dentro da célula..

As bactérias Gram positivas, possuindo uma parede espessa de peptidoglicano, formam mais complexos (cristal violeta-iodo), portanto retêm o corante.

Além disso, também influencia o fato de a parede das bactérias Gram positivas conter maior quantidade de ácidos insaturados, que apresentam grande afinidade por agentes oxidantes (Lugol).

Enquanto isso, as bactérias Gram negativas têm uma fina camada de peptidoglicano, que faz com que as bactérias formem menos complexos do que as Gram positivas.

Em seguida, vem a etapa de descoloração, em que as bactérias Gram positivas e Gram negativas se comportam de maneira diferente.

As bactérias Gram negativas contêm uma membrana externa rica em lipopolissacarídeos que fazem parte de sua parede celular. As gorduras são destruídas pelo contato com o álcool acetônico, de forma que a membrana externa se desestabiliza, liberando o cristal violeta.

É assim que ele é combatido com safranina ou fucsina básica, tornando-se vermelho.

No caso das bactérias Gram-positivas, resistem ao desbotamento porque o alvejante atua fechando os poros, evitando que o complexo cristal violeta / iodo vaze.

Portanto, a coloração com violeta cristal permanece estável, e não há espaço para safranina ou fucsina. É por isso que essas bactérias se coram de um azul profundo ou roxo.

materiais

O conjunto de coloração de Gram consiste em:

• Vidro violeta
• Lugol
• Álcool acetona
• Safranina ou fucsina básica

Preparação de corantes e reagentes

Solução de violeta cristal

Solução para:

Cristal violeta ------------- 2 gr

Álcool etílico 95% ----------- 20 cc

Solução B:

Oxalato de amônio ----------- 0,8 gr

Água destilada ------------- 80 cc

Para a preparação final do violeta de cristal, a solução A deve ser diluída 1:10 com água destilada e misturada com 4 partes da solução B. A mistura é armazenada por 24 horas antes do uso. Filtre para um frasco de coloração âmbar usando papel de filtro.

A quantidade a ser usada diariamente é transferida para um frasco conta-gotas âmbar.

Iodo-Lugol

Pesar e medir a quantidade indicada de cada composto, como segue:

Cristais de iodo ------------- 1gr

Iodeto de potássio ------------- 2gr

Água destilada ------------- 300 cc

O iodeto de potássio se dissolve aos poucos na água e então o iodo é adicionado. A solução é raspada em uma garrafa âmbar.

A quantidade a ser usada diariamente é transferida para um frasco menor de cor âmbar com conta-gotas.

Branqueamento

Álcool etílico a 95% -----------– 50 ml

Acetona ------------------ 50 ml

É preparado em partes iguais. Cubra bem, pois tende a evaporar.

Coloque em um frasco conta-gotas.

Esta preparação proporciona uma descoloração em tempo moderado de 5 a 10 segundos e é a mais recomendada.

Os iniciantes preferem usar apenas álcool etílico a 95%, onde o desbotamento é mais lento do que 10 a 30 segundos.

Enquanto os mais experientes podem usar acetona pura, onde a descoloração ocorre muito rapidamente de 1 a 5 segundos.

Contraste

Solução de estoque Safranin

Safranina -------------– 2,5 gr

Álcool etílico 95% --------– 100 cc

Após pesar a quantidade indicada de safranina, esta é dissolvida em 100 ml de álcool etílico a 95%.

A solução de safranina de trabalho é preparada a partir da solução estoque.

Para fazer isso, meça 10 cc da solução estoque, adicione 90 cc de água destilada para perfazer 100 ml.

Recomenda-se transferir a quantidade a ser usada diariamente para um frasco âmbar com conta-gotas.

Microorganismos que se coram fracamente Gram-negativos com a coloração de Gram-Hucker, como certos anaeróbios, Legionella sp, Campylobacter sp e Brucella sp, podem ser corados muito melhor usando a modificação de Kopeloff da coloração de Gram-Hucker, chamada coloração de Gram-Kopeloff.

Esta técnica transforma o corante safranina em fucsina básica. Com esta modificação é possível colorir efetivamente os citados microorganismos.

Armazenamento de reagentes

Os corantes preparados devem ser armazenados em temperatura ambiente.

Preparação do esfregaço da amostra a ser colorida

Uma amostra deve conter pelo menos 10 ⁵ microrganismos antes que seja provável a observação do microrganismo em um esfregaço. Os esfregaços podem ser feitos a partir da amostra direta ou de culturas em meio sólido ou líquido.

Os esfregaços devem ser uniformes, bem distribuídos e não muito espessos, para melhor visualização das estruturas presentes.

-Grama de amostras diretas

Gram de urina não centrifugada

A urina é misturada e 10 µl são colocados em uma lâmina. A observação de pelo menos uma bactéria / campo Dip indica que há uma infecção.

Isso significa que a cultura terá aproximadamente mais de 100.000 UFC / ml (10 ⁵ UFC / mL) de urina em 85% dos casos.

Este método não é útil para contagens de colônias abaixo de 100.000 UFC.

CSF Gram

O LCR deve ser centrifugado, o sobrenadante removido e o pellet espalhado em uma lâmina. Este líquido é estéril em condições normais; a observação de bactérias indica infecção.

Gram de amostras respiratórias

O escarro, o lavado brônquico ou broncoalveolar Gram, embora possa haver uma variedade de microrganismos, sempre guiará o diagnóstico, além de ser útil o tipo de células observadas.

No caso de escarro, o esfregaço deve ser preparado com as porções mais purulentas da amostra.

Grama de fezes

Não é recomendável realizar um Gram neste tipo de amostra, uma vez que não tem valor diagnóstico.

-Grama de colheitas

Eles podem ser feitos de duas maneiras, uma de culturas líquidas e outra de culturas sólidas.

Culturas líquidas

De culturas líquidas é extremamente simples; Vários assados ​​do caldo turvo são levados para baixo do queimador e colocados em uma lâmina limpa e seca, fazendo movimentos circulares do centro para a periferia, para distribuir o material uniformemente.

Deixe secar espontaneamente ao ar. Depois de seco, o material é fixado à folha com calor. Para isso, com o auxílio de uma pinça, a folha é passada 3 a 4 vezes através da chama do bico de Bunsen, com cuidado para não queimar o material.

A folha pode esfriar e é colocada na ponte de coloração.

Colheitas sólidas

Para realizar um esfregaço para a coloração de Gram de uma cultura sólida, proceda da seguinte forma:

Antes de escolher as colônias a serem retiradas, a lâmina deve ser preparada, colocando aproximadamente duas gotas de soro fisiológico estéril.

Se a placa de cultura original contém vários tipos diferentes de colônias, uma colônia isolada de cada será escolhida para realizar o Gram. Cada colônia será retirada com a alça de platina para dissolver na solução salina previamente colocada na lâmina.

Movimentos circulares são feitos do centro para a periferia, para distribuir homogeneamente a colônia no slide.

Deixe secar espontaneamente ao ar. Depois de seca, a folha é fixada com calor, conforme explicado anteriormente (flamejando a lâmina com o isqueiro), tomando cuidado para não queimar o material.

Este procedimento deve ser feito com cada tipo diferente de colônia. Em um pedaço de papel, a ordem do que é observado deve ser anotada, por exemplo:

Colônia 1: colônia beta-hemolítica amarela: cocos Gram positivos foram observados em grupos

Colônia 2: Colônia de cor creme, sem hemólise: foram observados cocobacilos Gram negativos.

Cada slide deve ser etiquetado para saber o que estamos observando.

Técnica

A técnica de coloração de Gram é extremamente fácil de executar e relativamente barata e não pode ser perdida em um laboratório de microbiologia.

É feito da seguinte maneira:

1. Fixe o esfregaço com calor e coloque sobre a ponte de coloração.
2. Cubra a lâmina completamente com violeta de cristal por 1 minuto.
3. Lave com água Não seque
4. Cubra a folha com a solução de lugol, deixe agir por 1 minuto. Lave com água Não seque.
5. Lixívia por 5-10 segundos com agitação suave em álcool acetona. Ou coloque a folha na posição vertical e deixe cair gotas do descolorante na superfície até que o excesso de vidro violeta não retido seja removido. Não exceda.
6. Lave com água Não seque.
7. Substitua a lâmina na ponte de coloração e cubra por 30 segundos com safranina (Gram-Hucker) ou 1 minuto com fucsina básica (Gram-Kopeloff).
8. Lave com água
9. Deixe secar ao ar espontaneamente na posição vertical.

Depois de seco, coloque 1 gota de óleo de imersão para observá-lo sob a objetiva 100X no microscópio óptico.

Utilitário

Esta técnica permite distinguir as diferenças morfotintorial da maioria das bactérias.

As leveduras também se distinguem por esta coloração. Eles pegam o cristal violeta, ou seja, tingem o Gram positivo.

Por outro lado, podem-se distinguir bacilos Gram-positivos formadores de esporos, nos quais se observa um espaço claro dentro do bacilo, onde se formou o endosporo, embora os esporos não se corem bem. Outras técnicas, como Shaeffer-Fulton, são usadas para colorir os esporos.

Ressalta-se que essa coloração não é utilizada para colorir todos os tipos de bactérias, ou seja, há casos em que a coloração não funciona.

Neste caso, podem ser mencionadas bactérias sem parede celular. Por exemplo: gênero Mycoplasma, esferoplastos, ureaplasma, formas L e protoplastos.

Ele também tinge muito bactérias com paredes ricas em ácidos micólicos, como Mycobacteria, e bactérias intracelulares, como Chlamydias e Rickettsias.

Também é ineficaz na coloração da maioria das bactérias espiroquetas.

Existem bactérias do mesmo gênero que podem ser observadas na mesma amostra como Gram positivas e Gram negativas. Quando isso ocorre é denominado coloração de Gram variável, que pode ser decorrente de alteração de nutrientes, temperatura, pH ou concentração de eletrólitos.

Erros comuns

Branqueamento exagerado

O exagero na etapa de descoloração pode levar à observação de falsos microrganismos Gram negativos.

Não esperar o tempo de secagem suficiente para adicionar o óleo de imersão

Pode causar a coloração de bactérias Gram positivas (falsos Gram negativos). Isso acontece porque em culturas antigas é provável que haja bactérias mortas ou estragadas e, nessas condições, as bactérias não retêm o cristal violeta.

Use uma solução de lugol muito antiga:

Com o tempo, o lugol perde suas propriedades e sua cor desbota. Se for utilizado o reagente já degenerado, não fixará bem o cristal violeta, portanto existe a possibilidade de se obter a visualização de falsos microrganismos Gram negativos.

Fundo azul

Um fundo com a cor adequada será vermelho. Um fundo azul indica que a descoloração foi insuficiente.

Referências

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