MAY GRÜNWALD-GIEMSA STAIN: JUSTIFICATIVA, TÉCNICA E USOS - BIOLOGIA - 2025

A coloração May Grünwald-Giemsa ou Pappenheim é uma técnica de coloração diferencial que mistura os reagentes Giemsa e May Grünwald. É utilizado para a diferenciação de células sanguíneas normais e anormais em esfregaços de sangue periférico e medula óssea, bem como para a coloração de cortes histológicos e amostras citológicas.

Ambos os reagentes -Giemsa e May Grünwald- são derivados da coloração do tipo Romanowsky, uma técnica que se baseia na combinação de corantes ácidos e básicos.

Esfregaço mostrando um neutrófilo segmentado e um milímetro em um caso de leucemia mieloide crônica, corado com a coloração May Grünwald Giemsa. Dr. Ramon Simon-Lopez (https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:LMC-1.JPG) por meio da Wikipedia.org.

A Giemsa aprimorou a técnica ao estabilizar a mistura da eosina, azul de metileno e seus derivados com o glicerol. Em vez disso, May Grünwald usa eosina e azul de metileno, usando metanol como solvente. Essa combinação estratégica tem rendido excelentes resultados.

Embora em termos de observação da morfologia celular atue de forma semelhante às manchas de Giemsa e Wright, essa técnica melhora as anteriores ao refinar a coloração dos parasitas causadores da malária, doença de Chagas, leishmaniose e tricomoníase.

Além disso, tem se mostrado uma técnica muito útil para o estudo citológico do líquido espermático. Tem se destacado não só por mostrar as características morfológicas dos espermatozoides, mas também por permitir a diferenciação de leucócitos, células epiteliais e células de espermatogênese com grande eficiência.

Base

A técnica segue a base das manchas de Romanowsky, nas quais os corantes ácidos têm afinidade seletiva para os componentes celulares básicos e os componentes ácidos atraem as manchas básicas.

Explicado de outra forma, tanto as estruturas celulares quanto os corantes têm cargas elétricas positivas ou negativas; cargas semelhantes se repelem e cargas diferentes se atraem.

Por exemplo, corantes básicos como o azul de metileno têm carga positiva e são atraídos por estruturas com carga negativa. É por isso que esse corante mancha os núcleos ricos em DNA e RNA que possuem grupos fosfato carregados negativamente.

Os grânulos de basófilos segmentados e os citoplasmas de leucócitos mononucleares contendo RNA também são corados.

Da mesma forma, o corante ácido carrega uma carga negativa, razão pela qual ele se liga a estruturas carregadas positivamente, como eritrócitos e grânulos de eosinófilos segmentados. Quanto aos grânulos de neutrófilos segmentados, eles fixam os dois corantes.

Variedade de corantes

Nesta técnica, uma combinação de reações entre corantes ortocromáticos e metacromáticos coexiste. Os ortocromáticos (eosina e azul de metileno) se ligam à estrutura celular com a qual estão relacionados e fornecem uma cor estável que não varia.

Por outro lado, os metacromatas (os derivados do azul de metileno azul A e do azul B) variam sua cor original uma vez que estão ligados à estrutura específica, podendo até mesmo haver uma variedade de tonalidades.

Por fim, o passo que a solução May Grünwald dá requer a presença de água, pois sem ela o corante penetrará nas estruturas, mas não se fixará. Para que isso aconteça, o corante deve se tornar polar ou ionizar e, assim, ser capaz de precipitar e se ligar a estruturas relacionadas.

Técnica

materiais

- Slides de slides.

- Pontes de coloração.

- Solução May-Grünwald.

- Coloração Giemsa.

- Água destilada.

Solução concentrada de corante May Grünwald

0,25 g de eosina-azul de metileno (mancha segundo May Grünwald) devem ser pesados ​​e dissolvidos em 100 ml de metanol. Em seguida, o preparo é misturado por 1 hora e deixado em repouso por 24 horas. No final do tempo, ele é filtrado.

Para aplicar a técnica, o corante May Grünwald deve ser diluído da seguinte maneira: para 200 ml de corante diluído, medir 30 ml da solução concentrada, adicionar 20 ml de solução tampão e 150 ml de água destilada ajustada para pH 7,2-7,3. Mais tarde, é misturado e filtrado.

Concentrado de corante Giemsa

Devem pesar-se 0,5 g de azul-eosina-azul de metileno (corante segundo Giemsa), dissolvidos em 50 ml de metanol e adicionar 50 ml de glicerina à mistura.

Para realização da técnica diluir 1:10 com solução tampão e deixar descansar por 10 minutos. Ele pode ser filtrado se necessário.

Preparação da solução tampão em pH 7,2

Eles devem ser pesados:

- 40 mg de dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4).

- 151 mg de hidrogenofosfato dissódico 12-hidratado (Na2HPO4).

Ambos os compostos são dissolvidos em 100 ml de água.

Procedimento de coloração de esfregaço de sangue ou medula óssea

Existem dois modos: um clássico e um rápido.

Modo clássico

1. Cubra os esfregaços por 2 a 3 minutos com a solução diluída de May-Grünwald.
2. Lave com água destilada tamponada para remover a solução anterior.
3. Cubra com a mesma solução de lavagem tamponada e deixe por 1 minuto. A ideia é que o corante anterior seja fixado às estruturas e que, ao mesmo tempo, as células sejam hidratadas.
4. Adicione 12 gotas de tintura de Giemsa diluída à água tamponada e sopre para misturar e homogeneizar. Deixe descansar por 15 a 20 minutos.
5. Lave os esfregaços com água destilada tamponada e deixe secar ao ar.
6. Foque e veja as células sanguíneas manchadas em um microscópio de luz usando a objetiva de 40X. Se necessário, o 100X pode ser usado.

Modo rápido

1. Cubra o esfregaço com corante May Grünwald diluído por 1 minuto.
2. Lave com água destilada tamponada.
3. Cubra com água tamponada e deixe descansar por 1 minuto.
4. Adicione o corante Giemsa diluído e deixe por 5 minutos.
5. Lave com água destilada tamponada e deixe secar ao ar.

As técnicas aqui descritas são uma orientação, mas deve-se levar em consideração que os procedimentos e tempos de coloração variam de acordo com a empresa comercial que distribui os reagentes. É aconselhável seguir os passos estritamente indicados por cada casa comercial.

Técnica para colorir esfregaços de fluido espermático

1- Cubra o esfregaço com uma camada fina da solução May Grünwald por 4 minutos.

2- Retire o corante e lave com água destilada.

3- Coloque uma camada de Giemsa diluído (1:10) em água destilada por 15 minutos.

4- Retire o corante e lave com água destilada.

5- Deixe secar e observe ao microscópio.

Cores esperadas com a coloração May Grünwald Giemsa

Especificações importantes

A técnica exige que os reagentes e soluções de lavagem tenham um pH ajustado para 7,2 -7,3, para que as afinidades dos corantes pelas estruturas celulares não sejam distorcidas e a cor final esperada não varie.

Formulários

Esta técnica é usada por laboratórios clínicos para corar esfregaços de sangue periférico e medula óssea, seções de tecido e citologias.

No campo hematológico, essa técnica é de vital importância no estudo das anormalidades das células em termos de forma, tamanho e número. É uma ferramenta muito valiosa para o diagnóstico de certas doenças, como leucemias e anemias.

Além disso, é de grande utilidade na busca de parasitas em áreas hematológicas (Plasmodium sp e Trypanosoma cruzi) ou histológicas (Leishmanias sp).

Citologia vaginal

Em relação à citologia vaginal, esta técnica é especialmente vantajosa para a observação de Trichomonas vaginalis. Este é um achado importante, pois sua presença simula quadros de carcinoma in situ que posteriormente desaparecem quando o parasita é eliminado.

Amostra de esperma

Tem sido uma ferramenta ideal para o estudo de amostras de esperma, pois fornece informações valiosas sobre a qualidade do esperma.

Os dados que oferece dizem respeito principalmente ao número e à morfologia, bem como às células concomitantes que podem estar presentes e que são de vital importância, como as células germinativas, os leucócitos e as células epiteliais.

Com essa análise é possível descrever as anormalidades observadas nos espermatozoides na cabeça, pescoço, peça intermediária e peça principal.

Além disso, também podem ajudar a evidenciar casos de hemospermia (presença de hemácias no sêmen) e leucospermia ou piospermia (aumento do número de leucócitos no sêmen).

Referências

1. Costamagna S, Prado M. Validação do teste a fresco, coloração de May Grünwald-Giemsa e Gram e meios de cultura para o diagnóstico de Trichomonas vaginalis. Parasitol. 2001; 25 (1-2): 60-64. Disponível em: scielo.
2. Laboratório Merck KGaA. May Grünwald eosina azul de metileno para microscopia.
3. "Mancha de May-Grünwald-Giemsa." Wikipédia, a enciclopédia livre. 15 de novembro de 2018, 14h37 UTC. 8 de janeiro de 2019, 04:29: en.wikipedia.org
4. Laboratório de Glass Chemicals Panreac. Reagentes para técnicas histológicas, hematologia e microbiologia. Disponível em: glasschemicals.com
5. Retamales E, Manzo V. Recomendação para a coloração de esfregaços de sangue para leitura do hemograma. Laboratório Biomédico Nacional e de Referência. Instituto de Saúde Pública do Chile.
6. Sarabia L. Spermiogram de acordo com os critérios da OMS. Programa de Biologia e Anatomia do Desenvolvimento. Faculdade de Medicina. Universidade do Chile. Disponível em: pp.centramerica.com