COLORAÇÃO NEGATIVA: JUSTIFICATIVA, TÉCNICA, VANTAGENS E DESVANTAGENS - BIOLOGIA - 2025

A coloração negativa é um método de coloração especial para evidenciar a presença da cápsula em alguns microrganismos, principalmente Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae e Cryptococcus neoformans-, a partir de espécimes clínicos ou culturas puras.

A amostra direta comumente usada para aplicar a coloração negativa é o líquido cefalorraquidiano. Essa técnica representa uma alternativa rápida para o diagnóstico presuntivo de meningites, principalmente Cryptococcus neoformans.

A. Tártaro dental corado com tinta nanquim, B. Cryptococcus neoformans var gatti fracamente encapsulado como ocorre na natureza, usando nigrosina. C. Cryptococcus neoformans var gatti com cápsula espessa como a encontrada em sua forma parasitária, utilizando nigrosina. D. Cryptococcus neoformans com tinta nanquim levemente diluída. Gisell Quinde, do Wikimedia Commons / CDC, via Wikimedia Commons / Crédito da foto: Provedores de conteúdo: CDC / Dr. Leanor Haley, via Wikimedia Commons

Da mesma forma, essa coloração pode ser aplicada no escarro e líquidos estéreis em geral, bem como em cepas obtidas de culturas jovens puras. Esta técnica usa nigrosina ou tinta nanquim para sua execução; portanto, é uma metodologia de aplicação muito simples e econômica, que fornece informações de grande valor diagnóstico em um curto espaço de tempo.

Nesse sentido, qualquer laboratório é capaz de realizar essa coloração. Obviamente, o laboratório deve ter pessoal competente, capaz de reconhecer leveduras Cryptococcus neoformans isoladas ou em brotamento e diferenciá-las de leucócitos e artefatos que a amostra possa apresentar.

Base

Nigrosine e nanquim funcionam de maneira semelhante; portanto, qualquer uma das duas substâncias pode ser usada indistintamente.

Essa técnica é chamada de coloração negativa porque atua de forma contrária às demais técnicas de coloração. Nisso, o que permanece intacto é a estrutura que se busca ou que se deseja ver; isto é, microorganismos.

Portanto, a coloração é baseada na coloração do fundo do esfregaço com uma cor escura. Nesse cenário, as estruturas encapsuladas se destacarão na cor clara ou incolor.

Em geral, as leveduras são refringentes, circundadas por um halo transparente que corresponde à cápsula. Isso ocorre porque a nanquim e a nigrosina são substâncias incapazes de penetrar no polissacarídeo que compõe a cápsula dos microrganismos vivos.

Vale ressaltar que outras estruturas que podem estar presentes na amostra direta, como leucócitos ou hemácias, também não penetram.

Porém, se os microrganismos estiverem mortos, o corante pode penetrar dentro deles, de forma que essa coloração também é útil para avaliar a viabilidade dos microrganismos.

Técnica

materiais

Nigrosina

A Nigrosina deve seu nome à cor preta que possui. É uma substância sintética que se obtém aquecendo a mistura de compostos orgânicos - como nitrobenzina, anilina e cloridrato de anilina -, utilizando um catalisador (ferro ou cobre) na referida reação.

Tinta chinesa

A tinta da China é uma substância usada principalmente pelos asiáticos para escrever, fazer obras de arte e pintar monocromática. É muito popular na cultura chinesa.

É obtido a partir da tinta de lula misturada com carvão vegetal pulverizado, produto da queima de árvores pouco resinosas.

Também é possível prepará-lo a partir da fuligem da incineração de hidrocarbonetos (óleos vegetais), junto com uma gelatina protéica que lhe dá a consistência certa para evitar a precipitação de partículas de carbono.

Especificações para amostragem

- Não requer jejum.

- A amostra de LCR, expectoração ou líquido estéril deve conter pelo menos 1 ml de volume e deve ser transferida para o laboratório à temperatura ambiente imediatamente.

- As amostras de LCR e de fluidos estéreis devem ser colhidas por um médico especializado.

- Também pode ser uma cultura pura de uma cepa suspeita ligada aos patógenos mencionados.

Execução da técnica com amostras diretas

- As amostras devem ser centrifugadas, em seguida o sobrenadante é descartado e o sedimento é retirado.

- Uma gota do material centrifugado (sedimento) e uma gota de nanquim ou nigrosina são colocadas em uma lâmina limpa.

- Deve ser bem misturado e coberto com uma lamela, permitindo que a gota se espalhe como uma película fina sem ultrapassar as bordas.

- Posteriormente, a preparação é montada no microscópio.

- Se a preparação for muito escura, pode ser diluída com água.

Execução da técnica com linhagens de cultura

- Uma porção muito pequena de uma cultura jovem é retirada com uma agulha de semeadura e dissolvida em uma gota de tinta nanquim previamente colocada em uma lâmina limpa.

- Uma lamela é colocada em cima.

- É observada no microscópio em 10X e depois em 40X.

Você também pode dissolver uma parte da colônia em água destilada, e de lá pegar uma gota e misturar com a tinta da Índia. Desta forma, o preparo não será tão espesso, permitindo observar as estruturas de forma isolada; se houver multidões, não será bem observado.

Outra metodologia é a seguinte:

- Coloque uma gota da cultura em suspensão em uma das extremidades da lâmina.

- Coloque uma gota de nigrosina na mesma extremidade e misture.

- Com a ajuda de outra lâmina, espalhe a amostra como se estivesse fazendo um esfregaço hematológico.

- Deixe secar e observe ao microscópio.

Observação microscópica

Você deve primeiro se concentrar em uma objetiva de 10X para ter uma visão ampla do campo. Posteriormente, deve-se verificar se existem espaços livres; se houver, foque 40X para ver os detalhes.

Vantagem

- É fácil de executar.

- É uma técnica barata.

- Este método não requer que o esfregaço seja fixado ao calor ou com produtos químicos; portanto, os microrganismos são observados sem distorções.

- O preparo fresco não precisa ser seco, podendo ser observado imediatamente, gerando resultados rapidamente.

Desvantagem

Depois de montadas, as preparações frescas devem ser observadas imediatamente; se secarem, não é mais possível observá-los e deve ser instalado um novo.

Tecido manchado com tinta nanquim

Outra função que a tinta nanquim pode cumprir é em laboratórios de patologia. Isso é aplicado a amostras de tecido extraídas cirurgicamente para marcar as margens de ressecção do tumor.

O tecido marcado é borrifado com ácido acético. Ele atua como um mordente e evita que a tinta vaze quando o tecido é submetido ao processamento de rotina para a preparação da biópsia.

O procedimento consiste em banhar o tecido em álcool e xilol e, a seguir, embebê-lo em cera de parafina. Essa marcação orienta o patologista na observação do tecido, indicando onde está a margem da ressecção cirúrgica ou outro ponto de interesse.

Referências

1. «Nigrosina». Wikipédia, a enciclopédia livre. 11 de julho de 2017, 22:46 UTC. 6 de janeiro de 2019, 16:56: en.wikipedia.org
2. "Tinta chinesa". Wikipédia, a enciclopédia livre. 1º de outubro de 2018, 03:08 UTC. 6 de janeiro de 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J e colaboradores. (2006). Pessoal de Trabalho da Comunidade Autônoma de Extremadura. Agenda específica Volume IV. Editorial MAD. Sevilha-Espanha, pp 211-212.
4. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006) Técnico de laboratório especializado, Serviço de Saúde Galego (SERGAS). Agenda de assuntos específicos volume 2. Editorial MAD. Sevilha-Espanha, pp 79-80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA