ESFERA DE AGAR PADRÃO: JUSTIFICATIVA, PREPARAÇÃO E USOS - BIOLOGIA - 2024

O ágar de contagem padrão é um meio de cultura sólido não seletivo, desenvolvido para a quantificação da carga microbiana aeróbia presente em amostras de água potável, efluentes, bebidas lácteas, entre outros alimentos. Este meio também é conhecido como ágar PCA, por sua sigla em Inglês Plate Count Agar. Foi criado em 1953 por Buchbinder, Baris e Goldstein.

O meio de ágar de contagem padrão é composto de extrato de levedura, tripteína, glicose, ágar e água destilada. Esta formulação contém elementos nutricionais básicos que permitem o desenvolvimento da carga microbiana aeróbia presente, não exigente.

Diluições decimais para contagem de CFUs em contagens de ágar padrão. Fonte: Quentin Geissmann

Como o meio não contém inibidores, as bactérias podem crescer sem quaisquer restrições, tornando-o ideal para a contagem geral de colônias. No entanto, a técnica de quantificação em placa não detectará todas as bactérias presentes, mas apenas aquelas que são capazes de crescer nas condições ambientais às quais o ágar de contagem padrão semeado é submetido.

Nesse sentido, a técnica de quantificação em placa geralmente busca determinar a quantidade de bactérias do tipo aeróbio mesofílico, ou seja, aquelas que se desenvolvem em temperaturas entre 25 e 40 ° C, com temperatura ótima de crescimento de 37 ° C..

Este grupo bacteriano é muito importante, porque a maioria das bactérias patogênicas para o homem se encontra ali.

Deve-se notar que às vezes pode ser interessante quantificar a quantidade de bactérias psicrofílicas presentes nos alimentos. Essas bactérias são aquelas que crescem em baixas temperaturas (<20 ° C) e são responsáveis ​​por fazer com que os alimentos se decomponham mais rapidamente, mesmo quando refrigerados.

Da mesma forma, as bactérias termofílicas, que se desenvolvem em uma faixa de 50 ° C a 80 ° C ou mais, podem ser importantes em certos tipos de alimentos, como alimentos enlatados.

A quantificação microbiana é expressa em unidades formadoras de colônias (CFU) por grama ou mililitro de amostra.

Base

O meio de contagem padrão é projetado para permitir o crescimento bem-sucedido de bactérias aeróbicas não fastidiosas, pois o extrato de levedura, a tripteína e a glicose fornecem os nutrientes necessários para um bom crescimento microbiano.

Por outro lado, o meio tem uma cor clara e um aspecto transparente, por isso é ideal para a visualização de colônias desenvolvidas pelo método de semeadura profunda (plate pouring).

A contagem de colônias pelo método de semeadura superficial da espátula Drigalski também é possível.

Quando a carga microbiana é alta, devem ser feitas diluições decimais da amostra do estudo para poder contar as UFC.

Ressalta-se que esse meio é recomendado pela American Public Health Association (APHA) para a contagem de mesófilos aeróbios.

Preparação

Pesar 23,5 g do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Para se dissolver completamente, a mistura deve ser aquecida mexendo sempre até ferver. As etapas subseqüentes dependem da técnica de semeadura a ser usada.

Para a técnica do prato de servir

Distribua dispensando 12 a 15 ml em tubos de ensaio. Posteriormente, esterilizar em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixe solidificar verticalmente na forma de um bloco. Guarde na geladeira até o uso.

Derreta o plugue quando for usá-lo. Uma vez derretido, mantenha-o em banho-maria a 44-47 ° C enquanto as amostras são preparadas.

Para semeadura superficial

Esterilize o meio em autoclave a 121 ° C e distribua 20 ml em placas de Petri estéreis. Deixe solidificar, inverta e guarde na geladeira até o uso.

Tempere as placas antes de usar. O pH do meio deve ser 7,0 ± 0,2.

Usar

O Agar de Contagem Padrão é usado na técnica de contagem aeróbia mesofílica durante a análise microbiológica de água e alimentos. A contagem dos mesófilos aeróbios é necessária, pois determina a qualidade sanitária da amostra em estudo.

A aplicação desta técnica (neste meio) permite a visualização macroscópica de colônias isoladas para sua quantificação.

Técnica de vazamento de placa (semeadura em profundidade)

-Processo

A técnica consiste no seguinte:

1) Homogeneizar a amostra para redistribuir as bactérias presentes.

2) A suspensão inicial é feita em frasco ou bolsa estéril, respeitando a proporção de 10 gr ou 10 ml de amostra em 90 ml de diluente (10 ^-1).

3) A partir da suspensão inicial, as diluições decimais pertinentes são feitas dependendo do tipo de amostra. Ex: (10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4). As diluições são feitas com água peptonada ou tampão fosfato.

Para isso, pegue 1 ml da suspensão inicial e coloque em 9 ml de diluente, continue as diluições se necessário, tomando agora 1 ml da diluição 10 ^-2 e assim sucessivamente.

4) Pegue 1 ml de cada diluição e coloque em placas de Petri estéreis vazias.

5) Adicionar a cada placa 12 a 15 ml de ágar de contagem padrão previamente derretido e sedimentado a 44 - 47 ° C.

6) Gire suavemente as placas para distribuir uniformemente a amostra ao longo do ágar e permitir que solidifique.

7) Inverter as placas e incubar a 37 ° C em aerobiose por 24 a 48 horas.

8) Ao final do tempo, as placas são examinadas e as colônias contadas na diluição que o permitir. Aquelas placas que possuem entre 30 a 300 CFU são escolhidas para a contagem.

A contagem pode ser feita manualmente ou você pode usar o equipamento contador de colônias.

Os valores permitidos por ml de amostra podem variar de um país para outro dependendo dos regulamentos que os regem.

-Cálculo do UFC

O cálculo geral é feito usando a seguinte fórmula:

Fórmula para o cálculo geral da quantificação de UFC. Fonte: Administração Nacional de Medicamentos, Alimentos e Tecnologia Médica (ANMAT). Análise microbiológica de alimentos, metodologia analítica oficial, microrganismos indicadores. 2014 Volume 3. Disponível em: anmat.gov.ar

Expresse os resultados em 1 ou 2 dígitos, multiplicando pela base 10 apropriada. Exemplo: se o resultado for 16.545, ele será arredondado com base no terceiro dígito para 17.000 e será expresso da seguinte forma: 1,7 x 10 ⁴. Agora, se o resultado for 16.436, arredonde para 16.000 e expresse 1,6 x 10 ⁴.

Técnica de semeadura de superfície

-Processo

-Inocular com 0,1 ml da amostra direta se ela for líquida, suspensão inicial 10 ^-1 ou das diluições consecutivas 10 ^-2, 10 ^-3 etc, no centro de uma placa de ágar de contagem padrão.

-Distribua a amostra uniformemente com uma espátula Drigalski ou uma vareta de vidro em forma de L. Deixe descansar por 10 minutos.

-Inverter as placas e incubar aerobicamente a 37 ° C por 24 a 48 horas.

- Continue a contar as colônias, escolha as placas que estão no intervalo entre 20 - 250 UFC.

-Cálculo do UFC

Para o cálculo, é aplicado o fator de diluição, que é o inverso. O número é arredondado para 2 dígitos significativos (arredondamento de acordo com o terceiro dígito) e expresso em potência de base 10. Por exemplo, se 224 CFU são contados na amostra sem diluição (10 ^-1), 22 x 10 ¹ CFU é relatado, mas se o valor fosse 225, 23 x 10 ¹ CFU é relatado.

Agora, se 199 CFU forem contados na diluição 10 ^-3, 20 x 10 ⁴ CFU serão relatados, mas se 153 CFU forem contados na mesma diluição, 15 x 10 ⁴ CFU serão relatados.

Controle de qualidade

O meio de cultura de contagem padrão pode ser avaliado usando cepas certificadas conhecidas, tais como: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Se o meio de cultura estiver em condições ótimas, espera-se um crescimento satisfatório em todos os casos, exceto para L. fermentum, que pode ter um rendimento regular.

Para avaliar a esterilidade do meio de cultura, uma ou duas placas de cada lote preparado (sem inoculação) devem ser incubadas a 37 ° C em aerobiose por 24 horas. Após este tempo, nenhum crescimento ou mudança de cor deve ser observado no meio.

Limitações

-Não derreta o ágar mais de uma vez.

-O meio preparado pode durar até 3 meses, desde que guardado no frigorífico e protegido da luz.

-Este meio não é adequado para microrganismos exigentes ou anaeróbicos.

Referências

1. Administração Nacional de Medicamentos, Alimentos e Tecnologia Médica (ANMAT). Análise microbiológica de alimentos, metodologia analítica oficial, microrganismos indicadores. 2014 Volume 3. Disponível em: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009. Disponível em:
3. Laboratórios Conda Pronadisa. Método Padrão Agar (PCA) de acordo com APHA e ISO 4833. Disponível em: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Contagem de placas de ágar. 2015. Disponível em: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B e Velázquez O. 2009. Técnicas de Análise Microbiológica de Alimentos. 2ª ed. Faculdade de Química da UNAM. México. Disponível em: depa.fquim.unam