AGAR MRS: FUNDAÇÃO, PREPARAÇÃO E USOS - BIOLOGIA - 2025

O ágar MRS é um meio de cultura sólido seletivo utilizado para o isolamento e enumeração de bactérias lácticas, principalmente do gênero Lactobacillus. Este ágar foi criado em 1960 por Man, Rogosa e Sharpe, com o mesmo nome, mas devido à sua complexidade, a abreviatura MRS é frequentemente utilizada.

É composto de proteose peptona, extrato de carne, extrato de levedura, glicose, monoleato de sorbitano, fosfato dipotássico, acetato de sódio, citrato de amônio, sulfato de magnésio, sulfato de manganês e ágar.

Man Rogosa e Sharpe Agar (MRS) semeado com Lactobacillus sp. Fonte: Foto doada para este artigo pelos autores: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Foto tirada durante a investigação intitulada: Avaliação de bactérias ácido-lácticas e Bifidobactérias com potencial probiótico no leite materno e fezes infantis.

Esta composição permite o desenvolvimento adequado de bactérias lácticas a partir de amostras clínicas, como fezes, secreção vaginal, amostras orais e leite materno, bem como laticínios e alimentos à base de carne.

Não é usado rotineiramente em laboratórios clínicos, porque as bactérias do ácido láctico raramente estão envolvidas em processos de doença. Porém, na área de microbiologia de alimentos, o uso do ágar MRS é mais frequente.

Por outro lado, este meio é utilizado por alguns Centros de Pesquisa cujo objetivo é o estudo de bactérias lácticas.

Base

O ágar Man, Rogosa e Sharpe tem uma composição bastante complexa. Dividindo a função de cada um de seus componentes, sua base pode ser explicada.

Proteose peptona, extrato de carne, extrato de levedura e glicose são nutrientes que fornecem a fonte de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais necessários para o crescimento bacteriano. Além disso, a glicose é a fonte de energia universal usada na maioria dos meios de cultura.

Por outro lado, para favorecer o crescimento das bactérias lácticas, é necessária a presença de cofatores (cátions) essenciais no metabolismo de Lactobacillus e bactérias relacionadas; Esses compostos são os sais de sódio, magnésio e manganês.

Da mesma forma, o monoleato de sorbitano ou polissorbato 80 são uma fonte importante de ácidos graxos, pois são absorvidos como nutrientes.

Além disso, o monoleato de sorbitano e o citrato de amônio atuam inibindo o desenvolvimento da flora acompanhante, especialmente as bactérias Gram negativas, proporcionando o caráter seletivo desse ágar.

Por fim, o ágar-ágar é o que dá consistência sólida ao meio.

Existem outras variantes do ágar Man Rogosa Sharpe; um deles é suplementado com cisteína (MRSc), muito útil para o isolamento de bifidobactérias, entre outros microrganismos. Por outro lado, existe o meio MRS suplementado com neomicina, paromomicina, ácido nalidíxico e cloreto de lítio, especial para a contagem seletiva de bifidobactérias em laticínios.

Preparação

Pesar 68,25 gramas do meio desidratado e dissolver em um litro de água destilada. Deixe agir por 5 minutos. Para dissolver completamente, vire para uma fonte de calor, mexendo sempre, e ferva por 1 a 2 minutos. Esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

Ao sair da autoclave, deixe repousar alguns minutos e distribua ainda quente em placas de Petri estéreis.

Deixe solidificar e inverter os pratos, encomende nas prateleiras e leve à geladeira até o uso. Deixe as placas aquecerem à temperatura ambiente antes de usar.

O pH do meio deve ser 6,4 ± 0,2. Algumas casas comerciais recomendam pH entre 5,5 a 5,9.

O meio desidratado é de cor bege e o preparado é âmbar escuro.

Tanto o meio desidratado quanto as placas preparadas devem ser armazenados a 2-8 ° C.

Formulários

As placas de ágar MRS podem ser semeadas na superfície (exaustão ou espátula Drigalski). Também pode ser semeado em profundidade. As placas devem ser incubadas a 37 ° C em microaerofilicidade (4% O ₂ e 5-10% CO ₂) por 24 a 72 horas.

O método de semeadura é escolhido de acordo com a finalidade pretendida (isolamento ou contagem).

Características das colônias

As supostas colônias de Lactobacillus crescem de cor esbranquiçada e têm uma aparência mucóide ou cremosa neste ágar. Eles devem ser posteriormente identificados.

Isolamento de bactérias de ácido láctico

Para isso, a semeadura de superfície é usada. As amostras a semear requerem um procedimento prévio.

No caso de amostras de leite materno, recomenda-se centrifugar 1 ml da amostra a 14.000 rpm por 10 minutos, a fim de remover a camada de gordura. 900 µl são descartados e nos 100 µl restantes o sedimento é suspenso e despejado na superfície do ágar MRS, devendo ser distribuído uniformemente com uma espátula Drigalski.

No caso de amostras de fezes, um (1) grama de fezes é pesado e homogeneizado em 9 mL de água peptonada estéril 0,1%, correspondendo a uma diluição de 1/10. Em seguida, diluições em série são feitas, até que uma diluição final de 10 ^{-4 seja obtida}.

Finalmente, 100 µl das diluições 10 ^-2, 10 ^-3 e 10 ^-4 são retirados e cada diluição é semeada em ágar MRS, distribuindo uniformemente com uma espátula Drigalski.

Contagem de bactérias de ácido láctico

Neste caso a semeadura é feita em profundidade.

Para amostras de leite materno, 1 mL é retirado e colocado em um tubo plástico cônico estéril. O ágar MRS é adicionado a uma temperatura aproximada de 40 ° C até um volume final de 25 mL, obtendo-se uma mistura homogênea. Posteriormente, é despejado em placas de Petri estéreis de maneira uniforme e deixado em repouso até a polimerização.

Para amostras de fezes, são feitas diluições, conforme descrito anteriormente. Pegue 1 mL de cada diluição e coloque em tubos plásticos cônicos estéreis. O ágar MRS fundido é adicionado a um volume de 25 mL.

A mistura de cada diluição é despejada uniformemente em placas de Petri estéreis. Finalmente, é deixado em repouso até a polimerização.

A colônia conta com ágar Man Rogosa e Sharpe (MRS). Fonte: Foto doada para este artigo. Autores: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Foto tirada durante a Pesquisa intitulada: Avaliação de bactérias lácticas e Bifidobactérias com potencial probiótico no leite materno e nas fezes infantis.

Nível de pesquisa

A cada dia, o estudo das bactérias do ácido láctico está ganhando mais interesse; Os pesquisadores buscam principalmente conhecer novas cepas e seu potencial como fermentos iniciais para padronização na fabricação de laticínios, entre outros usos.

Nesse sentido, Alvarado et al. (2007) usaram o ágar MRS para realizar um estudo no qual isolaram, identificaram e caracterizaram bactérias de ácido láctico presentes em um queijo venezuelano fumado andino artesanal.

No queijo encontraram a presença de bactérias dos gêneros Lactococcus e Lactobacillus, e concluíram que as misturas de cepas isoladas são adequadas como cepas iniciais na fabricação de queijos a partir de leite pasteurizado.

Por outro lado, Sánchez et al. (2017) utilizaram o ágar MRS para investigar a presença de bactérias ácido-láticas no trato digestivo de leitões, a fim de usá-las como probióticos nativos que aumentam a produtividade de leitões saudáveis.

Com esse meio eles conseguiram isolar quatro espécies: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae e Pediococcus pentosaceus.

Da mesma forma, Báez et al. (2019) utilizaram o ágar MRS para avaliar bactérias lácticas (BAL) e bifidobactérias com potencial probiótico no leite materno e nas fezes infantis.

Eles conseguiram isolar 11 BAL e 3 Bifidobacteria sp no leite materno, e 8 BAL e 2 Bifidobacteria sp. nas fezes. Todos atenderam a certos parâmetros que os comprovam como bactérias com atividade probiótica.

Os autores concluíram que tanto o leite materno quanto as fezes de bebês amamentados exclusivamente servem como fontes naturais de bactérias probióticas.

Controle de qualidade

Para avaliar a qualidade do ágar MRS, cepas de controle, tais como:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli e Bacillus cerei.

Os resultados esperados são de crescimento satisfatório para as 6 primeiras bactérias, enquanto E. coli e Bacillus cereus devem ser completamente inibidos.

Referências

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Isolamento, identificação e caracterização de bactérias de ácido láctico de um queijo artesanal andino defumado venezuelano. Seu uso como cultura inicial. Cient. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Disponível em: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Isolamento de bactérias de ácido láctico do trato digestivo do leitão. Rev. investiga. veterinario. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Disponível em: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Avaliação de bactérias lácticas e Bifidobactérias com potencial probiótico no leite materno e fezes de lactentes no município de Acevedo, Miranda 2017. Trabalho de graduação para qualificação para o bacharelado em Bioanálise. Universidade de Carabobo, Venezuela.
4. Laboratório Britannia. Ágar MRS. 2015. Disponível em: britanialab.com
5. Colaboradores da Wikipedia. Ágar MRS. Wikipédia, a enciclopédia livre. 10 de janeiro de 2018, 19:44 UTC. Disponível em: wikipedia.org Acessado em 17 de fevereiro de 2019.
6. Roy D. Media para o isolamento e enumeração de bifidobactérias em produtos lácteos. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.