AGAR SABOURAUD: FUNDAÇÃO, PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÕES - BIOLOGIA - 2025

O ágar Sabouraud, também conhecido como ágar Sabouraud dextrose, é um meio sólido, especialmente enriquecido para isolamento e desenvolvimento de fungos, como leveduras, bolores e dermatófitos.

Portanto, este meio não pode faltar em um laboratório de microbiologia para investigar a presença de fungos patogênicos ou oportunistas, tanto em amostras clínicas como não clínicas. Da mesma forma, também é ideal para o crescimento de bactérias filamentosas, como Streptomyces e Nocardias. Seu uso é muito amplo, pois pode ser utilizado na micologia humana, animal, vegetal e industrial.

A. Agar Sabouraud sem sementes. Agar B. Sabouraud semeado com uma levedura. Fonte: Fotos tiradas pelo autor MSc. Marielsa gil

Esse meio foi criado em 1896 pelo destacado dermatologista Raimond Sabouraud, que se tornou um especialista mundialmente conhecido em doenças do couro cabeludo, principalmente causadas por dermatófitos.

A sua criação foi tão importante que foi utilizada desde então e permanece até hoje, embora com algumas modificações.

Embora seja especial para fungos, bactérias podem crescer neste meio, portanto, para amostras com flora mista, a inclusão de antibióticos em seu preparo é necessária para inibir o crescimento da flora bacteriana porventura presente.

A escolha do antibiótico deve ser feita com cautela e levando em consideração o tipo de fungo a ser recuperado, uma vez que alguns são inibidos na presença de determinadas substâncias.

Base

O ágar Sabouraud dextrose é um meio que em sua formulação original é fracamente seletivo, devido ao seu pH ácido de 5,6 ± 0,2, porém ainda é possível o desenvolvimento de bactérias, principalmente em incubações prolongadas.

O meio contém peptona de caseína e digestão pancreática de tecido animal, que fornecem a fonte de carbono e nitrogênio para o crescimento de microrganismos.

Também contém alta concentração de glicose, que atua como fonte de energia, promovendo o crescimento de fungos sobre bactérias. Tudo isso misturado ao ágar-ágar, componente que lhe dá a consistência certa.

Por outro lado, o ágar Sabouraud dextrose pode ser seletivo se forem adicionados antibióticos.

Com antibióticos, é especialmente útil em amostras de feridas, úlceras abertas ou qualquer amostra em que se suspeite de grande contaminação bacteriana.

Combinações mais comumente usadas de ágar Sabouraud dextrose com antibióticos

-Ágar Saburaud com cloranfenicol: ideal para recuperar leveduras e fungos filamentosos.

- Ágar Sabouraud com gentamicina e cloranfenicol: quase todos os fungos filamentosos e leveduras crescem neste meio, e inibe um grande número de bactérias, incluindo Enterobacteria, Pseudomonas e Staphylococcus.

- Ágar Sabouraud com cicloheximida: é especialmente útil para amostras da pele ou do trato respiratório, desde que se suspeite de fungos dimórficos.

A cicloheximida deve ser usada com cautela; Embora seja usado para inibir o crescimento de fungos não patogênicos ou ambientais e leveduras que podem estar presentes como contaminantes em uma amostra, ele também inibe o crescimento de alguns fungos, como Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp e outros fungos oportunistas.

- Ágar Sabouraud com cloranfenicol mais cicloheximida: é utilizado principalmente para isolar dermatófitos e fungos dimórficos. Tem a desvantagem de inibir algumas espécies de fungos oportunistas, como Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes ou C. neoformans.

- Ágar Sabouraud com cloranfenicol, estreptomicina, penicilina G e cicloheximida: é ideal para amostras extremamente contaminadas com bactérias e fungos saprofíticos, mas tem a desvantagem de inibir o crescimento de Actinomyces e Nocardias, além dos fungos oportunistas já mencionados.

Preparação

Se você tiver os ingredientes separadamente, pode ser preparado da seguinte forma:

Ágar Sabouraud dextrose

Pesar:

- 40 gr de dextrose

- 10 g de peptona

- 15 gr de ágar-ágar

- Meça 1000 ml de água destilada

Todos os ingredientes são misturados, o pH é ajustado para 5,6. Os solutos são dissolvidos por ebulição, 20 ml do meio são distribuídos em tubos de 25 x 150 mm, sem rebordo e de preferência com uma tampa de algodão.

Tubos com tampa de algodão. Fonte: Foto tirada pelo autor MSc. Marielsa gil

Outros tamanhos de tubo também podem ser usados, dependendo da disponibilidade.

São autoclavados por 10 minutos em atmosfera de pressão (121 ° C). O tempo de autoclavagem não deve ser excedido. Ao sair da autoclave, os tubos são inclinados com o auxílio de um suporte até que se solidifiquem em bico de flauta.

Outra forma é dissolver os ingredientes aquecendo até ferver. Autoclave por 10 minutos no mesmo frasco e depois distribua 20 ml em placas de Petri.

Se você tiver um meio de ágar Sabouraud dextrose que já contém todos os ingredientes, pesar a quantidade especificada pela empresa comercial para um litro de água. O resto das etapas são iguais às descritas acima.

Ágar Sabouraud dextrose (modificação Emmons)

Pesar:

- 20 gr de dextrose

- 10 g de peptona

- 17 gr de ágar-ágar

- Meça 1000 ml de água destilada

Todos os ingredientes são misturados, o pH é ajustado para 6,9. Proceda da mesma forma que no caso anterior.

Existem casas comerciais que oferecem o meio com todos os ingredientes. Neste caso, pese e prepare conforme descrito no encarte.

Ágar Sabouraud dextrose (modificação Emmons) com cloranfenicol

Solução de estoque de cloranfenicol

- Pesar 500 mg de cloranfenicol base

- Meça 100 ml de etanol a 95%

- Misturar

O meio de ágar Sabouraud dextrose (Emmons) é preparado conforme descrito anteriormente e, adicionalmente, para cada litro de meio, adicione 10 ml de solução estoque de cloranfenicol antes da autoclavagem.

Sabouraud Emmons Dextrose Agar com Cicloheximida

Solução de estoque de cicloheximida

- Pesar 5 gr de cicloheximida

- Medir 100 ml de acetona

- Misturar

O meio de ágar Sabouraud dextrose (Emmons) é preparado como já descrito e, adicionalmente, para cada litro de meio, adicionar 10 ml de solução estoque de cicloheximida antes da autoclavagem.

Ágar Sabouraud dextrose (Emmons) com cloranfenicol e cicloheximida

O meio de ágar Sabouraud dextrose (Emmons) é preparado conforme descrito anteriormente e, adicionalmente, para cada litro de meio, adicionar 10 ml de solução estoque de cloranfenicol e 10 ml de solução estoque de cicloheximida antes da autoclavagem.

Outros antibióticos que podem ser adicionados

20.000 a 60.000 unidades de penicilina por litro de meio.

30 mg de estreptomicina por litro de meio.

Ambos devem ser incorporados após o meio ter sido autoclavado, ligeiramente resfriado (50-55 ° C).

0,04 g de neomicina por litro de meio.

0,04 g de gentamicina por litro de meio.

Considerações Especiais

Por segurança, é preferível semear ágar Sabouraud dextrose em tubos em forma de cunha (inclinados em bico de flauta) em vez de em placas de Petri, para evitar a dispersão e inalação dos esporos.

É importante que os tubos de ágar Sabouraud sejam cobertos com algodão e não com tampa de rosca, uma vez que as condições semianaeróbicas inibem a formação de esporos em algumas cepas, por exemplo, Coccidioides immitis. Além disso, a maioria dos fungos é aeróbica.

No caso de utilizar tampa de rosca, não feche hermeticamente.

Controle de qualidade

Os meios preparados devem passar por controle de qualidade para verificação de seu correto funcionamento. Para isso, certas cepas de controle são semeadas.

Para o ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol, podem ser utilizadas as cepas ATCC de Candida albicans, que devem apresentar excelente crescimento. Outra placa é inoculada com cepas de Escherichia coli, que devem ser completamente inibidas.

Uma placa não inoculada também é incubada na qual nenhum microrganismo deve crescer.

Para o ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol e cicloheximida, cepas de Trichophyton mentagrophytes podem ser usadas e devem se desenvolver bem. Outra placa é inoculada com uma cepa de Aspergillus flavus, na qual deve haver pouco ou nenhum crescimento. Além disso, uma placa não inoculada é incubada para demonstrar sua esterilidade.

Para o ágar Sabouraud dextrose com cicloheximida, são utilizadas cepas de Candida albicans, Trichophyton rubrum ou Microsporum canis, que devem apresentar bom crescimento.

Da mesma forma, uma cepa de Aspergillus flavus é incluída, apresentando pouco ou nenhum crescimento. Finalmente, incube uma placa não inoculada para controlar a esterilidade.

Formulários

Cultura primária

O ágar Sabouraud dextrose clássico contém 4 gramas de dextrose e é excelente como meio de isolamento primário, pois mostra a morfologia característica de cada fungo.

Também é excelente para demonstrar a produção de pigmentos. No entanto, não é o melhor meio de observar a esporulação.

Também não é recomendado para o cultivo de Blastomyces dermatitidis, que é inibido pela alta concentração de glicose presente.

Por outro lado, para o cultivo, certas considerações devem ser levadas em consideração.

Alguns fungos crescem melhor à temperatura ambiente, como bolores, outros crescem com sucesso a 37 ° C, como algumas leveduras, e outros podem crescer em ambas as temperaturas (fungos dimórficos).

Por este motivo, às vezes é necessário usar várias placas de ágar Sabouraud para a mesma amostra, uma vez que a semeadura em duplicata geralmente é feita para incubar uma placa em temperatura ambiente e outra a 37 ° C.

Por exemplo, Sporothrix schenckii é semeado em duas placas; um é incubado à temperatura ambiente para a obtenção da fase de bolor e o outro é incubado a 37 ° C para a obtenção da fase de levedura, mas neste último é necessário adicionar 5% de sangue ao meio.

Em outros casos, como em amostras de micetoma, são semeadas duas placas de ágar Sabouraud, uma com cloranfenicol e a outra com cicloheximida. O primeiro permitirá o crescimento de agentes causadores de micetomas de origem fúngica (Eumicetoma) e o segundo agentes causadores de micetomas de origem bacteriana, como os actinomicetomas.

Esporulação

O ágar Sabouraud dextrose modificado da Emmons contém 2 gramas de dextrose e é usado não apenas para isolamento, mas também para esporulação e preservação de fungos.

Nesse meio, cepas de Blastomyces dermatitidis podem ser recuperadas.

Conservação

Para preservar as culturas de cogumelos, eles podem ser armazenados no refrigerador (2-8 ° C). O tempo de conservação pode variar entre 2 a 8 semanas. Após esse tempo, eles devem ser subcultivados para repetir o processo.

Alguns fungos se mantêm melhor em temperatura ambiente, como Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum e Microsporum audounii.

A manutenção da cepa pode ser prolongada para evitar pleomorfismo se a dextrose for completamente removida do ágar e se a quantidade de ágar no meio for reduzida para evitar ressecamento.

Microculturas

Para a identificação de alguns fungos filamentosos, é necessário realizar microculturas com ágar Sabouraud ou outro meio especial para observar as estruturas de reprodução sexuada e assexuada.

Em micologia humana

É utilizado principalmente para o diagnóstico de doenças fúngicas, principalmente aquelas que afetam a pele e seus anexos (cabelos e unhas).

As amostras podem ser secreções, exsudatos, pele, cabelo, unhas, expectoração, LCR ou urina. Patógenos comumente isolados são dermatófitos, fungos que causam micoses subcutâneas e sistêmicas.

Micologia animal

Os animais são frequentemente afetados por infecções fúngicas, portanto o ágar Sabouraud é tão útil na micologia animal quanto em humanos.

Por exemplo, dermatófitos podem frequentemente afetar animais. É o caso do Microsporum canis var distortum, que freqüentemente infecta cães, gatos, cavalos, porcos e macacos. Da mesma forma, o Microsporum gypseum infecta cães, gatos e gado.

Aves como galinhas, galos e galinhas são afetadas por Microsporum gallinae.

Outros fungos, como o Zymonema farciminosum, também são causadores de doenças em animais, principalmente em cavalos, mulas e burros, produzindo importante inflamação nos vasos linfáticos.

Sporothrix schenkii e Histoplasma capsulatum afetam animais domésticos e humanos.

Micologia ambiental

Muitos fungos patogênicos ou oportunistas podem se concentrar a qualquer momento em um determinado ambiente, principalmente em salas de cirurgia e Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) de clínicas e hospitais. Portanto, é necessário realizar um controle deles.

Outros espaços vulneráveis ​​são bibliotecas e edifícios antigos, que podem ser afetados pela concentração de fungos ambientais.

Em estudos ambientais, o ágar Sabouraud dextrose é utilizado para o isolamento de fungos.

Micologia industrial

O ágar Sabouraud dextrose não pode faltar para o estudo de fungos contaminantes na produção de cosméticos, alimentos, bebidas, couro, têxteis, entre outros.

Micologia de plantas

As plantas também sofrem de doenças causadas por fungos, que afetam diferentes partes da planta, podendo inclusive encerrar a colheita, causando grandes prejuízos na agricultura.

Referências

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Diagnóstico microbiológico de micoses e estudos de sensibilidade antifúngica. Recomendações da Sociedade Espanhola de Doenças Infecciosas e Microbiologia Clínica. Disponível em: coesant-seimc.org
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5. Casas-Rincón G. Micologia Geral. 1994. 2ª Ed. Universidade Central da Venezuela, Edições da Biblioteca. Venezuela Caracas.