O ágar de sal de manitol ou sal de manitol é um meio sólido de cultura seletiva e diferencial. Foi criado por Chapman para o isolamento de cocos Gram-positivos patogênicos, especialmente Staphylococcus aureus.
No entanto, também é útil isolar Staphylococus epidermidis, que às vezes pode estar presente como um patógeno oportunista, e Staphylococcus saprophyticus, um patógeno urinário reconhecido, entre outras espécies.
A. Fiola com meio de ágar manitol salgado preparado. B. Placas de ágar manitol salgado semeadas com cepas bacterianas de manitol em fermentação e não fermentação. Fonte: A e B: Fotos tiradas pelo autor MSc. Marielsa Gil.
Alguns Enterococcus são capazes de crescer neste meio, assim como certos bastonetes formadores de esporos Gram-positivos.
Este meio é muito útil na análise de amostras clínicas, mas também é utilizado no estudo microbiológico de alimentos e no controle de qualidade de produtos industriais, como cosméticos, medicamentos, entre outros.
O Ágar Manitol Salgado é composto por extratos e peptonas de carne bovina, tripteína, manitol, cloreto de sódio, vermelho de fenol e ágar.
Base
O ágar manitol é seletivo devido à sua alta concentração de sal. A salinidade atua como uma substância inibidora e previne o crescimento de bactérias Gram negativas.
Também é diferencial pela presença do carboidrato manitol e do indicador de pH vermelho de fenol. A partir disso, as bactérias capazes de fermentar o manitol produzem ácidos, acidificando o meio, tornando as colônias e o meio amarelados.
Por outro lado, colônias que não fermentam manitol crescem no meio levando os nutrientes fornecidos pelos extratos e peptonas da carne e tripteína. A partir daí, as bactérias extraem o carbono, o nitrogênio, as vitaminas e os minerais necessários para seu crescimento.
As colônias, neste caso, podem ser rosa forte ou fraca, e o meio permanece da mesma cor ou muda para fúcsia.
O ágar é a substância que dá consistência ao meio.
Preparação
Para preparar um litro de ágar manitol salgado, 111 g do meio desidratado da companhia comercial preferida são pesados e dissolvidos em 1000 ml de água destilada, usando um frasco.
O calor é aplicado com agitação frequente do meio para melhorar o processo de dissolução. Ferva por um minuto.
O frasco é colocado na autoclave a 121 ° C por 15 minutos.
Ao final do tempo, retire o frasco da autoclave, deixe descansar e sirva de 15 a 20 ml em placas de Petri estéreis quando a temperatura estiver em torno de 50 a 55 ° C.
É permitido solidificar, encomendando de forma invertida em plaqueros e mantendo na geladeira até o uso. Antes de semear uma amostra, espere a placa atingir a temperatura ambiente.
As placas são semeadas por estrias ou por semeadura superficial com uma espátula drigalski. O pH final do meio preparado deve ser 7,4 ± 0,2
A cor do meio desidratado é bege claro e a cor do meio preparado é vermelho alaranjado.
Formulários
Devido à sua alta seletividade, este meio é ideal para a semeadura de amostras com flora mista em que se busca a presença de Staphylococus aureus, principal patógeno deste gênero.
Nesse sentido, um de seus usos mais frequentes é na análise microbiológica de exsudatos faríngeos e amostras de secreção nasal, principalmente para detecção de portadores assintomáticos de S. aureus.
Alguns países implementaram essa análise como um requisito obrigatório para pessoas que desejam trabalhar como vendedores de alimentos.
Esse controle evita a contratação de pessoas portadoras de S. aureus, evitando, assim, intoxicações alimentares massivas, devido ao consumo de alimentos contaminados com enterotoxina estafilocócica.
Também pode ser incluído na semeadura de infecções de feridas, hemoculturas, LCR, lavado broncoalveolar, entre outros.
O ágar manitol salgado é útil para isolar novamente colônias de culturas de urina de ágar CLED ou ágar sangue cujo Gram revelou aglomerados de cocos Gram positivos.
É válido também na análise microbiológica de alimentos, água potável, solos, entre outras aplicações.
Controle de qualidade
Uma vez preparado um lote de placas com ágar manitol salgado, é aconselhável realizar um controle de qualidade. As cepas de controle são semeadas para mostrar se há crescimento ou não.
As cepas de Staphylococcus aureus conhecidas podem ser usadas como um controle positivo. Deve crescer satisfatoriamente desenvolvendo colônias amarelas, e o meio também fica da mesma cor.
Da mesma forma, é conveniente incluir uma cepa conhecida de Staphylococcus epidermidis. Deve crescer satisfatoriamente, desenvolvendo colônias rosa, e o meio permanece da mesma cor ou escurece para um rosa mais forte.
Como controle negativo, são utilizadas cepas que não devem crescer neste meio. Por exemplo, uma cepa conhecida de Escherichia coli ou Klebsiella pneumoniae pode ser cultivada. O resultado esperado é a inibição completa, ou seja, nenhum crescimento.
Além disso, uma placa não inoculada deve ser incubada. Nele não deve haver crescimento ou mudança de cor.
É importante que a placa não seja utilizada se houver sinais de deterioração, como contaminação, desidratação, descoloração, entre outros.
Pensamentos finais
Ao usar meio de ágar manitol salgado, existem alguns aspectos importantes a serem considerados:
- A obtenção de um crescimento de colônias amarelas não indica que seja Staphylococcus aureus. Deve ser lembrado que algumas cepas de Enterococcus são capazes de crescer neste meio e fermentar o manitol, assim como certos bastonetes Gram-positivos formadores de esporos.
Portanto, é importante realizar um Gram na colônia e um teste para catalase.
-Por outro lado, deve-se considerar que outras espécies de Staphylococcus que não aureus também são capazes de fermentar o manitol. Portanto, é importante fazer a subcultura da colônia em um caldo nutritivo para retirar daí e realizar o teste de coagulase.
Dentre as espécies de Staphylococcus de importância clínica para o homem que fermentam manitol estão: S. aureus, S. simulans, S. capitis ssp capitis, S. capitis ssp urealyticus, S. xylosus, S. cohnii ssp urealyticum, entre outras.
Outros podem dar uma reação variável, ou seja, às vezes positiva e às vezes negativa. Alguns são S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. warneri, S. intermedius, entre outros.
-Não é recomendável retirar colônias diretamente do ágar manitol para realizar o teste de coagulase, pois a alta concentração de sal no meio pode interferir no resultado.
-Finalmente, recomenda-se incubar as placas semeadas com manitol salgado por até 48 horas, pois algumas cepas de S. aureus podem fermentar lentamente o manitol, embora não seja muito frequente.
Referências
- Britannia Laboratories. Ágar manitol salgado. 2015. Disponível em: britanialab.com
- "Agar de manitol salgado". Wikipédia, a enciclopédia livre. 31 de outubro de 2018, 19:08 UTC. 17 de janeiro de 2019, 20:55, disponível em: es.wikipedia.org.
- Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
- Laboratórios BD. BD Mannitol Salt Agar. 2013. Disponível em: bd.com.