AGAR SANGUE: JUSTIFICATIVA, USOS E PREPARAÇÃO - BIOLOGIA - 2025

O ágar sangue é um meio de cultura sólido enriquecido diferencial, mas não seletivo. É utilizado para a recuperação e crescimento de uma grande variedade de microrganismos de amostras clínicas ou para subculturas.

O ágar sangue clássico deve ser incluído para a semeadura da maioria das amostras clínicas recebidas no laboratório; exceto para amostras de fezes onde não é útil, a menos que preparado com certas modificações.

Placa de ágar sangue

Este meio de cultura consiste basicamente em ágar base enriquecido e 5% de sangue. O ágar base pode variar de acordo com a necessidade, mas será composto principalmente por peptonas, aminoácidos, vitaminas, extrato de carne, cloreto de sódio, ágar, entre outros.

Quanto ao sangue, normalmente é necessário entrar em contato com um biotério para se obter sangue de animais, como ovelhas, coelhos ou cavalos. No entanto, nem sempre isso é possível e às vezes é usado sangue humano.

O meio de ágar sangue pode ser preparado em laboratório ou pode ser adquirido já feito de empresas dedicadas. O preparo desse meio é um dos mais delicados, qualquer descuido em seu preparo resultará em um lote contaminado.

Por isso, todos os cuidados possíveis devem ser tomados e ao final deve ser feito um controle de qualidade incubando a 37 ° C 1 placa para cada 100 preparadas.

Base

Staphylococcus aureus cultivado em ágar sangue. Nathan Reading no Flickr Nathan R. no Twitter, via Wikimedia Commons Já foi mencionado que o ágar sangue tem a característica de ser um meio enriquecido, diferencial e não seletivo. A base para cada uma dessas propriedades é explicada a seguir.

O ágar sangue é um meio enriquecido porque contém 5 a 10% de sangue em uma base de ágar como seu aditivo principal. Ambos os compostos contêm muitos nutrientes e esta propriedade permite que a maioria das bactérias cultiváveis ​​cresça neles.

Esse crescimento ocorre sem restrição; por esta razão, não é seletivo. Porém, se forem adicionados a esse meio compostos que impeçam o crescimento de alguns microrganismos e favoreçam o de outros, ele se torna seletivo. Este é o caso se certos tipos de antibióticos ou antifúngicos são adicionados.

Da mesma forma, o ágar sangue é um meio diferencial, pois permite distinguir 3 tipos de bactérias: beta-hemolítica, alfa-hemolítica e gama-hemolítica.

Os beta-hemolíticos são aqueles que têm a capacidade de lisar ou quebrar completamente os glóbulos vermelhos, formando um claro halo ao redor das colônias, por isso produzem ß ou ß-hemólise e os microrganismos são chamados de ß-hemolíticos.

Exemplos de bactérias ß-hemolíticas são Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolíticos são aqueles que realizam hemólise parcial, onde a hemoglobina é oxidada a metemoglobina, gerando uma coloração esverdeada ao redor das colônias. Este fenômeno é conhecido como α ou α-hemólise e as bactérias são classificadas como α-hemolíticas.

Exemplos de bactérias α-hemolíticas são Streptococcus pneumoniae e Streptococcus do grupo viridans.

Finalmente, existem as chamadas bactérias hemolíticas gama ou não hemolíticas. Estes crescem no ágar sem gerar alterações nele, um efeito conhecido como γ-hemólise, e os microrganismos são γ-hemolíticos.

Exemplo de bactéria γ-hemolítica: algumas cepas de Streptococcus do grupo D (Streptococcus bovis e Enterococcus faecalis).

Formulários

O meio de cultura de ágar sangue é um dos mais comumente usados ​​no laboratório de microbiologia.

Entre os microrganismos capazes de crescer em meio de ágar sangue estão: bactérias aeróbias estritas, facultativas, microaerofílicas, anaeróbias, bactérias Gram positivas ou Gram negativas, bactérias de crescimento rápido ou lento.

Algumas bactérias exigentes nutricionalmente também crescem, assim como fungos e leveduras. Da mesma forma, é útil para subcultivar ou reativar cepas que são metabolicamente muito fracas.

No entanto, a escolha do tipo de sangue e do ágar base irá variar dependendo do provável microrganismo suspeito de recuperação e do uso para o qual a placa será usada (cultura ou antibiograma).

Escolha do tipo de sangue

O sangue pode ser de cordeiro, coelho, cavalo ou humano.

O mais recomendado é o sangue de cordeiro, com algumas exceções. Por exemplo, para isolar espécies de Haemophilus, onde o sangue recomendado é de cavalo ou coelho, uma vez que o sangue de cordeiro possui enzimas que inibem o fator V.

O menos recomendado é humano, porém é o mais utilizado, talvez por ser o mais fácil de obter.

O sangue deve ser desfibrinado, obtido sem qualquer tipo de aditivo e de animais saudáveis. Para o uso de sangue humano, vários fatores devem ser levados em consideração:

Se o sangue vier de indivíduos com infecções bacterianas, eles terão anticorpos específicos. Nessas condições, é provável que o crescimento de algumas bactérias seja inibido.

Se for obtido no banco de sangue, contém citrato e certas bactérias podem não crescer em sua presença. Por outro lado, se o sangue vier de pacientes que estão tomando antibióticos, o crescimento de bactérias suscetíveis pode ser inibido.

E se o sangue for de uma pessoa diabética, o excesso de glicose interfere no bom desenvolvimento dos padrões de hemólise.

Escolha do tipo de ágar base

O ágar base usado para a preparação do ágar sangue pode ser muito amplo. Entre eles estão: ágar nutriente, ágar de infusão de cérebro e coração, ágar tripticase soja, ágar Müeller Hinton, ágar Thayer Martin, ágar Columbia, ágar Brucella, ágar Campylobacter, etc.

Usos do ágar sangue de acordo com o meio de base utilizado para sua preparação

Ágar nutriente

Essa base é a menos utilizada, pois vai cultivar principalmente bactérias não exigentes, como bacilos entéricos, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, entre outras. Não é recomendado isolar Streptococcus.

Agar de infusão de cérebro e coração (BHI)

É um dos mais utilizados como base para ágar sangue, pois contém os nutrientes necessários para o crescimento da maioria das bactérias, incluindo Streptococcus sp e outras bactérias exigentes. Embora não seja apropriado observar padrões de hemólise.

O sangue de cordeiro é geralmente usado com esta base.

Variantes de ágar sangue também podem ser preparadas, onde outros compostos são adicionados para isolar certos microrganismos. Por exemplo, o Agar de infusão de cérebro e coração suplementado com sangue de coelho, cistina e glicose pode ser usado para isolar Francisella tularensis.

Enquanto, com telurito de cistina, é útil para o isolamento de Corynebacterium diphteriae. Sangue humano ou de cordeiro pode ser usado.

Com a primeira beta-hemólise será vista como um halo estreito, enquanto com a segunda o halo será muito mais amplo.

Da mesma forma, esta base juntamente com bacitracina, amido de milho, sangue de cavalo e outros suplementos de enriquecimento (IsoVitaleX), é usada para o isolamento do gênero Haemophilus sp de amostras respiratórias.

Além disso, se a combinação de antibióticos cloranfenicol - gentamicina ou penicilina - estreptomicina com sangue de cavalo for adicionada, é ideal para o isolamento de fungos patogênicos exigentes, mesmo com maior rendimento do que o ágar Sabouraud glicose. É especialmente útil no isolamento de Histoplasma capsulatum.

Agar soja tripticase

Essa base é a mais recomendada para melhor observação do padrão de hemólise e para a realização de exames diagnósticos como taxa de optoquina e bacitracina. É o ágar sangue clássico usado rotineiramente.

Com esta base você também pode preparar o ágar sangue especial para Corynebacterium diphteriae, com telurito de cistina e sangue de cordeiro .

Da mesma forma, a combinação deste ágar com sangue de cordeiro, mais canamicina-vancomicina, é ideal para o crescimento de anaeróbios, especialmente Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton

Essa base suplementada com sangue é usada para fazer o antibiograma de microrganismos fastidiosos, como Streptococcus sp.

Também é útil para o isolamento de bactérias como Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Este meio é ideal como base para ágar sangue quando houver suspeita do gênero Neisseria, especialmente Neisseria meningitidis, uma vez que N. gonorrhoeae não cresce em ágar sangue.

Também é usado para testar a suscetibilidade a Neisseria meningitidis.

Agar columbia

Esta base é excelente para semear amostras de biópsia gástrica para Helicobacter pylori.

O meio é preparado adicionando 7% de sangue de cordeiro desfibrinado com antibióticos (vancomicina, trimetoprima, anfotericina B e cefsulodina) para restringir o crescimento de outros tipos de bactérias que possam estar presentes.

Esta mesma base suplementada com sangue humano ou de cordeiro, ácido nalidíxico e colistina é útil para isolar Gardnerella vaginalis. Também é ideal para avaliar a suscetibilidade antimicrobiana aos antibióticos do mesmo microrganismo.

Além disso, é utilizado para a preparação de ágar sangue para cultivo de anaeróbios, com adição de aminoglicosídeos e vancomicina.

Esta base permite a observação adequada dos padrões de hemólise.

Ágar Brucella

Este meio usado como base para ágar sangue juntamente com a adição de vitamina K é ideal para o cultivo de bactérias anaeróbias. Nesse caso, recomenda-se o uso de sangue de cordeiro.

Ágar Campylobacter

Ágar Campylobacter suplementado com 5% de sangue de ovelha e 5 antibióticos (cefalotina, anfotericina B, trimetoprima, polimixina B e vancomicina), é o meio utilizado para isolar Campylobacter jejuni em amostras de fezes.

Preparação

Cada casa comercial traz no verso do recipiente as instruções para o preparo de um litro de meio de cultura. Os cálculos correspondentes podem ser feitos para preparar a quantidade desejada, dependendo do ágar base selecionado.

Pesar e dissolver

O ágar base é desidratado (pó), portanto deve ser dissolvido em água destilada com pH ajustado para 7,3.

A quantidade indicada pelo ágar base escolhido é pesada e dissolvida na quantidade correspondente de água em um frasco, a seguir aquecida em fogo moderado e misturada com movimentos rotativos até que todo o pó esteja dissolvido.

Esterilizar

Uma vez dissolvido, esterilize em autoclave a 121 ° C por 20 minutos.

Agregado de sangue

Ao sair da autoclave, o frasco é deixado esfriar até a temperatura ficar entre 40 e 50 ° C; É uma temperatura que a pele humana suporta e ao mesmo tempo o ágar ainda não se solidificou.

Para isso, o frasco é tocado com a mão e se o calor for tolerável, é a temperatura ideal para adicionar a quantidade correspondente de sangue desfibrinado (50 ml para cada litro de ágar). Misture delicadamente para homogeneizar.

A passagem da agregação sanguínea é fundamental, pois se for realizada com o meio muito quente os glóbulos vermelhos se rompem e o meio não será utilizado para observar hemólise.

Se for adicionado muito frio, ele se aglutinará e a superfície do meio não ficará lisa para permitir uma pontuação adequada.

Despeje em placas de Petri

Sirva em placas de Petri estéreis imediatamente após homogeneizar o sangue. Aproximadamente 20 ml são despejados em cada placa de Petri. Este procedimento é feito em uma capela de fluxo laminar ou próximo ao queimador.

Ao servir o ágar sangue nas placas de Petri, nenhuma bolha de ar deve permanecer na superfície da placa. Se isso acontecer, a chama do bico de Bunsen é passada rapidamente sobre a placa para eliminá-los.

As placas são solidificadas e armazenadas em um refrigerador (2-8 ° C) invertido até o uso. Antes de usar as placas de ágar sangue, elas devem ser temperadas (permitir que atinjam a temperatura ambiente) para poderem ser semeadas.

Os pratos preparados duram aproximadamente 1 semana.

Referências

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5. Centro de Diagnóstico Veterinário do Laboratório CEDIVET. Guatemala. Disponível em: trensa.com.
6. Koneman E, Allen S, Janda W., Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. (5ª ed.). Argentina, Editorial Panamericana SA