CALDO EC: BASE, PREPARAÇÃO E USOS - BIOLOGIA - 2024

O caldo EC ou caldo de Escherichia coli é um meio de cultura líquido seletivo. Este meio é recomendado pelos Métodos Padrão para contagem de coliformes totais e fecais, pela técnica do número mais provável (NMP) em amostras de água e alimentos, onde o principal agente envolvido é Escherichia coli.

O caldo EC é composto de tripteína, lactose, sais biliares, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico, cloreto de sódio e água. Sua fórmula é estrategicamente desenhada para favorecer o crescimento de coliformes totais e fecais e prevenir o desenvolvimento de outros microorganismos acompanhantes.

Representação figurativa da preparação do caldo CE. Fonte: Pixabay.com

A bactéria Escherichia coli é o principal coliforme fecal presente como contaminante em fontes de água e alimentos, sendo causadora de importantes distúrbios gastrointestinais.

Deve-se notar que existem muitos sorotipos de Escherchia coli; Dentre eles podemos citar os enterohemorrágicos (EHEC), enteroinvasivos (EIEC), enteopatogênicos (EPEC), enterotoxigênicos (ETEC) e enteroagregativos (EAEC).

Este meio tem a capacidade de permitir o desenvolvimento de todos eles, mas sem conseguir diferenciá-los uns dos outros. Isso requer testes adicionais.

O estudo microbiológico de água e alimentos pelo número mais provável (NMP) para pesquisa de coliformes totais e fecais é um protocolo que consiste em várias fases; fase presuntiva, fase de confirmação e fase de conclusão. O caldo CE é usado na fase confirmatória.

Base

Caldo CE

O meio EC é baseado em fornecer os elementos nutricionais necessários para o desenvolvimento ideal dos coliformes totais e fecais, onde estão incluídas as bactérias Escherichia coli.

Esses elementos nutricionais são fornecidos pela tripteína, sendo uma excelente fonte de peptídeos e aminoácidos. Além disso, também contém lactose, um carboidrato fermentável que fornece energia e permite mostrar se a bactéria produz gases.

Por outro lado, o meio contém sais biliares que conferem o caráter seletivo, pois inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos que porventura estejam presentes na amostra.

Da mesma forma, o fosfato dipotássico e o fosfato monopotássico atuam como um sistema de equilíbrio de pH. Esse sistema é necessário, pois a lactose contida no caldo tende a acidificar o meio quando é fermentado por microrganismos, mas isso é compensado pelos sais de fosfato.

Portanto, esses elementos são essenciais, uma vez que a acidez descontrolada pode afetar o bom desenvolvimento dos microrganismos procurados.

O cloreto de sódio, por sua vez, estabiliza o meio osmoticamente, enquanto a água é o solvente dos solutos presentes e dá consistência líquida ao meio.

Caldo EC modificado por novobiocina

Okrend e Rose criaram uma variedade de caldo EC, chamado caldo EC modificado com novobiocina. A modificação consistiu em reduzir a concentração de sais biliares e adicionar 20 mg / dl de novobiocina.

Esta modificação favorece a recuperação de cepas enterohemorrágicas de Escherichia coli (O157: H7).

Este sorotipo bacteriano causa colite hemorrágica grave que pode levar à síndrome urêmica hemolítica (SHU); que por sua vez pode gerar insuficiência renal aguda, com alta taxa de mortalidade que pode chegar a 50% em idosos.

Devido à morbimortalidade causada anualmente por esta bactéria devido ao consumo de alimentos contaminados, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) recomenda enfaticamente o uso deste meio.

Preparação

Caldo CE

Pesar 37,4 g do meio desidratado e dissolver em 1 litro de água destilada. A mistura deve ser deixada em repouso por 5 minutos. Posteriormente, em uma fonte de calor, acaba se dissolvendo por agitação frequente.

Uma vez dissolvido, é distribuído em tubos de ensaio pré-condicionados com um tubo Durham dentro. Esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

O pH do meio deve ser 6,9 ± 0,2. A cor do meio desidratado é bege e o meio preparado é âmbar claro.

Os caldos são mantidos na geladeira até o uso. Na hora do uso, os caldos devem estar em temperatura ambiente.

Por outro lado, o caldo EC também pode ser preparado em dupla concentração.

Caldo EC modificado por novobiocina

Pesar 36,7 g de meio desidratado e dissolver em 1 litro de água. O resto da preparação é igual ao descrito acima.

Usar

Análise de coliformes totais e fecais

O caldo CE é ideal para a fase confirmatória do estudo de coliformes pelo método NMP, tanto em amostras de água, como em produtos farmacêuticos e alimentos.

Caldos turvos de lactose, produtores de gás, obtidos na fase presuntiva, devem ser semeados novamente em caldos biliares verdes brilhantes a 2% e caldo EC.

Para coliformes totais, os caldos EC são incubados aerobicamente por 24 a 48 horas a 37 ° C, e para coliformes fecais eles são incubados aerobicamente por 24 a 48 horas a 44 ° C.

Em ambos os casos, é interpretado da seguinte forma: tubos turvos com produção de gás são considerados positivos. Se não houver produção de gás em 24 horas, a incubação continua por até 48 horas.

Os caldos EC positivos vão para a fase de confirmação completa, que consiste na ressemeadura em meios seletivos como ágar Mac Conkey, ágar EMB ou ágar Endo.

Se o caldo usado for CE modificado com novobiocina, recomenda-se que os tubos positivos sejam semeados novamente em ágar Mac Conkey com sorbitol.

Controle de qualidade

Cada lote de meio preparado deve ter controle de qualidade. Primeiro, a esterilidade do meio deve ser avaliada. Nesse sentido, um ou dois caldos são incubados sem inoculação em aerobiose por 24 horas a 37 ° C. O resultado esperado é um caldo transparente, sem turvação ou mudança de cor.

Em segundo lugar, deve-se avaliar o crescimento de cepas conhecidas, para isso podem ser utilizadas as seguintes bactérias: Escherichia coli, ATCC 8739, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028.

Em todos os casos, espera-se um desenvolvimento microbiano satisfatório, observando-se um caldo turvo com produção de gás para E. coli e nenhum gás para Salmonella.

Outras cepas que podem ser incluídas no controle são: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212. Essas cepas devem ser totalmente inibidas.

recomendações

-A colocação dos tubos de Durham é essencial para o estudo dos coliformes.

-Distribua o meio nos tubos de ensaio antes da esterilização, nunca depois.

-Não use se o meio tiver mais de 3 meses.

-Não use se for observada alguma alteração nas características usuais do meio.

Referências

1. Britannia Laboratories. EC Medium. 2015. Disponível em: britanialab.com
2. E. coli enterohemorrágica. O Centro de Segurança Alimentar e Saúde Pública. 2010. Disponível em: cfsph.iastate.edu
3. Neogen Corporation. Meio EC. Disponível em: foodsafety.neogen.com
4. Neogen. Meio EC modificado com novobiocina. Disponível em: foodsafety.neogen.com
5. Jure M, Condorí S, Leotta G, Chinen I, Miliwebsky E, Allori C, Aulet O, de Castillo M. Detecção, isolamento e caracterização de Escherichia coli produtora de toxina Shiga de carne moída fresca de açougueiros em Concepción, província de Tucumán. Microbiol Rev Arg; 2010, 42 (4): 284-287. Disponível em: www.scielo.org.