CALDO TETRATIONATO: JUSTIFICATIVA, PREPARAÇÃO E USOS - BIOLOGIA - 2025

O caldo tetrationato ou caldo TT é um meio de cultura líquido seletivo para o enriquecimento e recuperação de cepas do gênero Salmonella. Foi criado por Müeller e posteriormente modificado por Kauffmann, por isso há quem o chame de caldo Müeller-Kauffmann.

O meio original continha proteose peptonas, carbonato de cálcio e tiossulfato de sódio. Kauffmann adicionou sais biliares a ele e criou outra modalidade com o verde brilhante. Essas substâncias inibem o crescimento de coliformes, deixando o meio livre para o desenvolvimento de bactérias patogênicas, no caso a Salmonella.

Adicionar a solução de iodo de iodo ao caldo de tetrationato. Fonte: Manuel Almagro Rivas

A modificação teve muito sucesso porque aumentou significativamente a sensibilidade do meio. Por este motivo, atualmente é útil para a pesquisa de Salmonelas em qualquer tipo de amostra, mas principalmente para fezes sólidas ou líquidas e alimentos.

Sua preparação consiste em duas fases; O meio comercial é uma base para preparar o caldo de tetrationato e, posteriormente, para que o tetrationato possa ser formado, uma solução iodada de iodo é adicionada para completar o meio.

A American Public Health Association (APHA) recomenda o uso do Caldo Tetrationato suplementado com verde brilhante para enriquecimento de amostras para Salmonella, por ser mais seletivo que o Caldo Tetrationato e Caldo Selenita.

Em geral, o caldo tetrationato é ideal quando se suspeita da presença de bactérias do gênero Salmonella em pequenas quantidades ou quando são abusadas por exposição a substâncias inibidoras ou por processos industriais que minimizam sua viabilidade.

Base

As peptonas presentes correspondem à digestão pancreática da caseína e à digestão péptica do tecido animal. Eles fornecem a fonte de carbono, nitrogênio e nutrientes gerais para o crescimento bacteriano.

Por sua vez, o tiossulfato de sódio reage com a solução iodada para formar tetrationato. Isso inibe o crescimento de coliformes e favorece o desenvolvimento de bactérias que contêm a enzima tetrationato redutase, entre elas está o gênero Salmonella, mas também Proteus.

Os sais biliares também atuam como uma substância inibidora para a maioria das bactérias Gram positivas e algumas bactérias Gram negativas (coliformes).

O carbonato de cálcio absorve as substâncias tóxicas geradas pela decomposição do tetrationato, que forma o ácido sulfúrico. Nesse sentido, o carbonato de cálcio neutraliza a acidez, mantendo estável o pH do meio.

No caso da modalidade verde brilhante, essa substância aumenta o poder seletivo do caldo de tetrationato ao inibir outros microrganismos que não o gênero Salmonella.

Preparação

- Caldo de tetrationato

Solução de iodo iodo

Pesar:

• 6 gramas de iodo.
• 5 g de iodeto de potássio.

O iodeto de potássio é dissolvido em aproximadamente 5 ml de água destilada estéril, então o iodo é adicionado aos poucos enquanto a mistura é aquecida. Depois de completamente dissolvido, perfazer até a marca com água destilada estéril até atingir o volume final de 20 ml.

Meio base para caldo de tetrationato

Pesar 46 gramas do meio desidratado e suspender em 1 litro de água destilada estéril. Misture e aqueça até dissolver completamente, pode levar para ferver apenas por alguns minutos. Não autoclave. A base do meio é deixada arrefecer até aproximadamente 45 ° C e nessa altura são adicionados 20 ml da solução iodada.

Depois de adicionar a solução iodada ao meio, ela deve ser usada imediatamente. Se não quiser usar toda a mistura, proceda da seguinte forma:

Distribuem-se nos tubos 10 ml do meio base, e somente aos inoculados com as amostras adiciona-se 0,2 ml da solução iodada.

Aquelas que não vão ser utilizadas ainda podem ser armazenadas na geladeira, porém como o meio não é esterilizado, o ideal é preparar a quantidade exata que for necessária.

A cor do meio antes da adição da solução de iodo é branco leitoso com um precipitado branco e após a adição é marrom com um precipitado denso. O precipitado observado é normal e corresponde ao carbonato de cálcio que não se dissolve. O pH final do meio é 8,4 ± 0,2.

- Variante de caldo de tetrationato com verde brilhante

Para preparar o caldo de tetrationato verde brilhante, todas as etapas descritas acima são realizadas, mas adicionalmente, 10 mL da solução verde brilhante preparada a 0,1% serão adicionados à mistura.

Verde brilhante

Esta solução é preparada da seguinte forma:

Pesar 0,1 g de verde brilhante e suspender em 100 ml de água destilada. Aquecer até à fervura para obter a dissolução total. Conservar em frasco âmbar.

Usar

Para amostras de fezes (cultura de fezes), o protocolo é o seguinte:

Inocular 1 g de fezes sólidas ou 1 ml de fezes líquidas em um tubo com 10 ml de caldo de tetrationato pronto para uso. Agite vigorosamente e incube aerobicamente a 43 ° C por 6-24 horas.

Posteriormente, retirar uma alíquota de 10 a 20 µl do caldo e fazer a subcultura em meio seletivo para Salmonella, como ágar SS, ágar XLD, ágar verde brilhante, ágar entérico Hektoen, entre outros.

Paralelamente, meios seletivos para Salmonella devem ser inoculados com a amostra direta (fezes) sem enriquecimento. Para espécimes de esfregaço retal, descarregue o material coletado no tubo e proceda conforme descrito acima.

Para amostras de alimentos, pese 10 g de alimento sólido ou 10 ml de alimento líquido e inocule um frasco com 100 ml de caldo de tetrationato pronto para uso. Proceda da mesma forma como descrito acima, mas incube a 37 ° C.

Como pode ser visto, a relação entre a amostra e o caldo será sempre de 1:10.

Controle de qualidade

As cepas de controle conhecidas podem ser usadas para testar o meio de cultura. As mais amplamente utilizadas são as cepas certificadas ATCC.

As cepas a serem utilizadas são Salmonella typhimurium ATCC 14028, Salmonella abony DSM 4224, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 19433 e Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Um crescimento excelente é esperado para cepas de Salmonella, enquanto Escherichia coli pode ter crescimento fraco ou regular, e cepas Gram positivas (Enterococcus e Staphylococcus) são parcial ou totalmente inibidas.

recomendações

-Como este meio não inibe o crescimento de Proteus, alguns laboratórios costumam colocar 40 mg / L de novobiocina para prevenir o desenvolvimento desta cepa microbiana. O antibiótico deve ser adicionado antes da solução de iodo.

-Após a preparação do meio incluindo a solução de iodo iodo, não deve demorar mais de 2 horas para ser inoculado.

- Na distribuição do meio nos tubos, a mistura deve ser homogeneizada continuamente para ressuspender o precipitado formado.

- Em amostras menos contaminadas, o caldo de tetrationato é incubado a 35-37 ° C, e em amostras altamente contaminadas, a incubação a 43 ° C é recomendada.

Referências

1. Laboratório Conda Pronadisa. 2010. Caldo base tetrationato de acordo com Müeller-Kauffmann. Disponível em:
2. Laboratórios BD. 2003. Tetrathionate Broth Base. Disponível em:
3. Britannia Laboratories. 2015. Caldo à base de tetranato. Disponível em:
4. BBL Media. 2005. Preparado em tubos para o cultivo da espécie Salmonella.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
6. Flores-Abuxapqui J, Puc-Franco M, Heredia-Navarrete M, Vivas-Rosel M, Franco-Monsreal J. Comparação entre meios de cultura de selenito de sódio e tetrationato de sódio, ambos incubados a 37 ° C e 42 ° C durante o isolamento de Salmonella spp nas fezes de portadores. Rev Biomed 2003; 14 (4): 215-220