CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTO DESEMPENHO (HPLC): JUSTIFICATIVA, EQUIPAMENTOS, TIPOS - QUÍMICA - 2025

A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica instrumental utilizada em análises químicas em que se permitem separar misturas, purificar e quantificar seus componentes, e estudos posteriores. É conhecido pela abreviatura HPLC, derivada do inglês: High Performance Liquid Chromatography.

Assim, como o próprio nome indica, funciona manipulando líquidos. Consistem em uma mistura composta pelo analito ou amostra de interesse e um ou mais solventes que atuam como fase móvel; ou seja, aquele que arrasta o analito por todos os equipamentos de HPLC e pela coluna.

Equipamento de HPLC. Fonte: Dqwyy

HPLC é amplamente usado por laboratórios de análise de qualidade em muitas empresas; como produtos farmacêuticos e alimentos. O analista em questão deve preparar a amostra, a fase móvel, verificar a temperatura e outros parâmetros, e colocar os frascos dentro da roda ou carrossel para que o equipamento faça as injeções automaticamente.

O equipamento de HPLC é acoplado a um computador por meio do qual podem ser observados os cromatogramas gerados, bem como iniciar as análises, controlar a vazão da fase móvel, programar o tipo de eluição (isocrática ou gradiente) e ligar os detectores (UV -Vis ou espectrofotômetro de massa).

Base

Ao contrário da cromatografia líquida convencional, como a cromatografia em coluna cheia de papel ou sílica gel, a HPLC não depende da gravidade para o líquido molhar a fase estacionária. Em vez disso, trabalha com bombas de alta pressão, que irrigam a fase móvel ou eluente através da coluna com maior intensidade.

Desta forma, não é necessário derramar a fase móvel de vez em quando através da coluna, mas sim o sistema o faz continuamente e com vazões mais altas.

Mas a eficiência dessa técnica não se deve exclusivamente a esse detalhe, mas também às minúsculas partículas de carga que compõem a fase estacionária. Por ser menor, sua área de contato com a fase móvel é maior, por isso irá interagir melhor com o analito e suas moléculas se separarão mais.

Essas duas características, mais o fato de a técnica permitir o acoplamento de detectores, tornam o HPLC muito superior à cromatografia em camada fina ou em papel. As separações são mais eficientes, a fase móvel viaja melhor pela fase estacionária e os cromatogramas podem detectar qualquer falha na análise.

Equipamento

Diagrama simplificado do funcionamento de um equipamento HPLC. Fonte: Gabriel Bolívar.

Acima está um diagrama simplificado de como funciona um equipamento HPLC. Os solventes estão em seus respectivos recipientes, dispostos com mangueiras, de forma que a bomba leve um pequeno volume para o equipamento; temos assim a fase móvel.

A fase móvel ou eluente deve ser desgaseificada primeiro, de forma que as bolhas não afetem a separação das moléculas do analito, que se mistura com a fase móvel uma vez que o equipamento tenha feito as injeções.

A coluna cromatográfica está localizada dentro de um forno que permite regular a temperatura. Assim, para diferentes amostras, existem temperaturas adequadas para conseguir separações de alto desempenho, bem como um amplo catálogo de colunas e tipos de preenchimentos ou fases estacionárias para análises específicas.

A fase móvel com o analito dissolvido entra na coluna e, a partir dela, as moléculas que "sentem" menos afinidade pela fase estacionária eluem primeiro, enquanto as que são mais retidas por ela eluem depois. Cada molécula eluída gera um sinal exibido no cromatograma, onde são observados os tempos de retenção das moléculas separadas.

E, por outro lado, a fase móvel após passar pelo detector acaba em um recipiente de resíduos.

Tipos de HPLC

Existem muitos tipos de HPLC, mas entre todos eles os mais destacados são os quatro seguintes.

Cromatografia de fase normal

A cromatografia de fase normal se refere àquela em que a fase estacionária é polar por natureza, enquanto a fase móvel é apolar. Embora seja chamado de normal, na verdade é o menos utilizado, sendo a fase reversa a mais difundida e eficiente.

Cromatografia de fase reversa

Sendo uma fase inversa, agora a fase estacionária é apolar e a fase móvel polar. Isso é especialmente útil em análises bioquímicas, pois muitas biomoléculas se dissolvem melhor em água e em solventes polares.

Cromatografia de troca iônica

Nesse tipo de cromatografia, o analito, com carga positiva ou negativa, movimenta-se pela coluna, substituindo os íons que abriga. Quanto maior a carga, maior sua retenção, razão pela qual é amplamente utilizado para separar complexos iônicos de metais de transição.

Cromatografia de exclusão de tamanho

Esta cromatografia, ao invés de separar, é responsável por purificar a mistura resultante. Como o próprio nome sugere, o analito é separado não mais dependendo de quão intimamente relacionado com a fase estacionária, mas de acordo com seu tamanho e massas moleculares.

Moléculas menores serão mais retidas do que moléculas grandes, uma vez que estas não ficam presas entre os poros dos preenchimentos da coluna polimérica.

Formulários

HPLC permite análises qualitativas e quantitativas. Do lado qualitativo, ao comparar os tempos de retenção do cromatograma sob certas condições, a presença de um composto particular pode ser detectada. Essa presença pode ser indicativa de doença, adulteração ou uso de drogas.

Portanto, é um computador que faz parte dos laboratórios de diagnóstico. Da mesma forma, encontra-se nas indústrias farmacêuticas, pois permite verificar a pureza do produto, bem como a sua qualidade no que diz respeito à sua dissolução no meio gástrico. Os materiais iniciais também são submetidos a HPLC para purificá-los e garantir um melhor desempenho na síntese de fármacos.

HPLC permite a análise e separação de misturas complexas de proteínas, aminoácidos, carboidratos, lipídios, porfirinas, terpenóides e é essencialmente uma excelente opção para trabalhar com extratos vegetais.

E, finalmente, a cromatografia de exclusão molecular permite selecionar polímeros de diferentes tamanhos, uma vez que alguns podem ser menores ou maiores do que outros. Desta forma, obtêm-se produtos com massas moleculares médias baixas ou altas, sendo este um fator determinante nas suas propriedades e futuras aplicações ou síntese.

Referências

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Quantitative Analytical Chemistry. (quinta edição). PEARSON Prentice Hall.
2. Bussi Juan. (2007). Cromatografia líquida de alta performance.. Recuperado de: fing.edu.uy
3. Wikipedia. (2019). Cromatografia líquida de alta performance. Recuperado de: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Cromatografia líquida de alta performance. Recuperado de: chemguide.co.uk
5. Matthew Barkovich. (05 de dezembro de 2019). Cromatografia líquida de alta performance. Chemistry LibreTexts. Recuperado de: chem.libretexts.org
6. GP Thomas. (15 de abril de 2013). Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) - Métodos, benefícios e aplicações. Recuperado de: azom.com